研究課題
近年、ジカ熱、エボラ出血熱、エイズ等の新興・再興感染症、輸入感染症が人類の新たな脅威となってきている。人的交流のグローバル化、高齢化、地球温暖化等の様々な要因により、感染症は今後ますます深刻化することが懸念される。本研究は、我々が独自に開発した「リンパ球チップ」という革新的なリンパ球単離技術を基盤として、病原菌特異的ヒトTリンパ球を効率良く同定し、単一のTリンパ球からT細胞受容体（TCR）cDNAを迅速に単離する方法「T-ISAAC」を開発し、個人のウイルスペプチド特異的T細胞の同定および機能評価を行い、「ジカ熱、エイズの個のペプチドワクチン開発の基盤技術を確立」することを目的とする。平成29年度は、MHC/ペプチド特異的なTリンパ球をリンパ球チップで検出(T-ISAAC)するために、チップ内のTリンパ球をMHC/ペプチドで刺激し、刺激されたTリンパ球が産生するサイトカインを検出する新しいシステムを開発した。具体的には、リンパ球チップにOT1特異的T細胞を播種し、マイクロウエルにOT1ペプチドを添加したところ、Tリンパ球がOT1ペプチドに反応してサイトカインを産生した。この結果は、従来の通説であったTリンパ球活性化メカニズムtrans-activationと異なる新しい活性化メカニズムcis-activationを初めて明らかにしたものであり、学術的貢献度は高い。次に、T-ISAACのTCR遺伝子の効率的な増幅条件を詳細に検討し、従来TCRのα鎖とβ鎖の両方が増幅できる効率は、回収した単一T細胞の60%程度であったものを、RT及びPCRの条件、用いるプライマー等を見直すことで、90%以上の単一T細胞より、α鎖とβ鎖の両方が増幅できる条件を決定した。この結果は、T-ISSACによるTCR遺伝子の網羅的取得に大きく寄与する。
2: おおむね順調に進展している
現在の進捗状況は、平成29年度の研究計画のうち、1) ペプチド特異的T細胞の検出法（T-ISAAC）を確立、2）TCR遺伝子の増幅条件の検討については終了し、3）T-ISAACの機能評価の迅速化については、現在、最終段階にある。1）ペプチド特異的T細胞の検出法（T-ISAAC）の確立については、MHC/ペプチド特異的なTリンパ球をリンパ球チップで検出(T-ISAAC)するために、チップ内のTリンパ球をMHC/ペプチドで刺激し、刺激されたTリンパ球が産生するサイトカインを検出する新しいシステムを開発した。まず、直径10μm のマイクロウェルに、１個ずつTリンパ球を播種し、チップ上で細胞をPMA/イオノマイシンで刺激することにより、100万個のTリンパ球のサイトカイン産生を単一細胞レベルで検出できる方法を確立した。次に、リンパ球チップにOT1特異的T細胞を播種し、マイクロウエルにOT1ペプチドを添加したところ、Tリンパ球がOT1ペプチドに反応してサイトカインを産生することを確認した。コントロールペプチドの添加ではサイトカイン産生は見られなかった。2）TCR遺伝子の増幅条件の検討については、T-ISAACのTCR遺伝子の効率的な増幅条件を詳細に検討した。従来TCRのα鎖とβ鎖の両方が増幅できる効率は、回収した単一T細胞の60%程度であったものを、RT及びPCRの条件、用いるプライマー等を見直すことで、90%以上の単一T細胞より、α鎖とβ鎖の両方が増幅できる条件を確率した。3）T-ISAACの機能評価の迅速化については、TAP(transcriptionally active PCR)法を応用した機能解析の改良を行っている。この方法を確立することで、機能解析が大幅に短縮できる。このように、研究計画は、申請書の計画と照らし合わせて、概ね順調に進展していると自己評価できる。
今後の研究計画として、1) T-ISAACの機能評価の迅速化、2）T-ISAACによるウイルスペプチド特異的T細胞の同定、3）TCRの機能評価のためのMHC/ペプチドテトラマーの新規作成法の開発、4）健常人でのジカ熱ウイルスおよびエイズウイルスペプチド特異的T細胞の同定と機能評価、の研究を進める。1) T-ISAACの機能評価の迅速化については、TAP(transcriptionally active PCR)法を応用した機能解析の改良を行い、TCRの機能解析を10日間から4日間に短縮することを目指す。2）T-ISAACによるウイルスペプチド特異的T細胞の同定については、T-ISAACを用いて、EBVペプチド特異的T細胞を検出し、TCRの特異性および機能評価を行う。3）TCRの機能評価のためのMHC/ペプチドテトラマーの新規作成法の開発については、我々が以前までに哺乳類細胞株にて作製に成功した膜型の1本鎖MHC/ペプチド（SCT: single chain trimer）を可溶化型として発現させ、更にテトラマー化する方法を開発する。モデルとして、EBウイルスの抗原BRLF1ペプチドのSCTを作製してテトラマー化し、既に我々がクローニングしたBRLF1特異的TCRを発現させたT細胞と結合するかどうかを実証する。4）健常人でのウイルスペプチド特異的T細胞の同定と機能評価については、特定のMHCに提示されやすいペプチドを予測できるString-Kernel Support Vector Machineを用いたHLA結合性ペプチド予測プラットフォームから、特定のMHCに提示されうるジカ熱ウイルスおよびエイズウイルスのHLA拘束性ウイルスペプチドを予測し、これらのペプチドに応答するTリンパ球が末梢血中に存在するかどうかを、健常人でT-ISAACを用いて検証する。
すべて 2017 その他
すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 2件、 査読あり 3件) 学会発表 (32件) (うち国際学会 3件)
Scientific Reports
巻: 7 ページ: 3663
10.1038/s41598-017-03855-x
Journal of Cancer
巻: 8 ページ: 2542～2553
10.7150/jca.19918
Proceedings of the National Academy of Sciences
巻: 114 ページ: E8204～E8213
10.1073/pnas.1703559114
