次世代チップT-ISAACを用いたジカ熱、エイズペプチドワクチンの開発

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H04219
• 研究機関: 富山大学
• 研究代表者: 村口 篤 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 特別研究教授 (20174287)
• 研究分担者: 岸 裕幸 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 教授 (60186210) ; 小澤 龍彦 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (10432105) ; 小林 栄治 富山大学, 大学院医学薬学研究部(医学), 助教 (70459733) ; 宇高 恵子 高知大学, 教育研究部医療学系基礎医学部門, 教授 (40263066)
• 研究期間 (年度): 2017-04-01 – 2020-03-31
• キーワード: 感染症治療学 / ペプチドワクチン / チップ技術

研究実績の概要

【1】平成29年度に確立したT-ISAAC法を用いてEBVペプチド特異的T細胞を検出し、TCRの特異性と機能評価を行った。具体的には、HLA-A24拘束性のEBウイルス由来BRLF-1、EBNA3A、及びHLA-A02拘束性のEBウイルス由来BMLF-1に対して特異的なTCRの存在を確認しているボランティアより末梢血リンパ球を単離し、CD8+Tリンパ球に濃縮し、リンパ球チップに播種してペプチドと4～6時間共培養し、分泌されたインターフェロン-γを検出した。刺激時間、ペプチド濃度などを検討し、検出のための至適条件を決定した。さらに、これら検出した細胞が確かにペプチドに応答しているかを検証するために、検出できた細胞を1つずつ回収し、得られたTCR遺伝子の機能評価を行った。HLA-A24及びA02陽性の健常人ボランティアより各1名以上、抗原として合計3種類以上で行った。

【2】TCRの機能評価として種々の細胞株を用いた方法が考えられるが、MHC/ペプチドテトラマーによるFACS解析が最も簡易的である。しかしながら、MHC/ペプチドテトラマーは従来法では大腸菌で作製しているため、研究室レベルでは困難であった。そこで、我々が以前までに哺乳類細胞株にて作製に成功した膜型の1本鎖MHC/ペプチド（SCT: single chain trimer）を可溶化型として発現させ、更にテトラマー化する方法を開発した。モデルとして、EBウイルスの抗原BRLF1ペプチドのSCTを作製してテトラマー化し、既に我々がクローニングしたBRLF1特異的TCRを発現させたT細胞と結合するかどうかを実証した。研究室レベルで、1週間程度で安価（10万円程度）で大量（10 mg以上）のMHC/ペプチドテトラマーを作成できる方法を確立した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

平成29年度および平成30年度の研究期間に、以下の研究成果を得ている。研究成果は各年度の研究計画に鑑み、「おおむね順調に進展している」と自己評価した。
【1】MHC/ペプチド特異的なTリンパ球をリンパ球チップで検出するために 、チップ内のTリンパ球をMHC/ペプチドで刺激し、刺激されたTリンパ球が産生するサイトカインを検出する新システム（T-ISAAC）を開発した。具体的には、H-2Kb MHC class IとOVAペプチド特異的TCRおよびH-2Db MHC クラスⅠとH-Y 抗原特異的TCRを用いて実験を行った。
【2】これまでは、α鎖とβ鎖の両方が増幅できる効率は、回収した単一T細胞の60%程度だったが、RT及びPCRの条件、用いるプライマー等を見直し、90%以上の単一T細胞より、α鎖とβ鎖の両方が増幅できる条件を確立した。
【3】T-ISAACの開発に際し、単離したTCRの機能解析を簡素化するために、TAP法を応用した機能解析の改良を行った。本改良により、TCRの機能解析を10日間から4日間に短縮することが可能となった。
【4】T-ISAACを用いて、HLA-A24拘束性のEBウイルス由来ペプチド及びHLA-A02拘束性のEBウイルス由来ペプチドに対して特異的なTCRを有するボランティアの末梢血CD8+Tリンパ球を、リンパ球チップに播種してペプチドで刺激し、分泌されたインターフェロン-γを検出し、細胞を1つずつ回収し、得られたTCR遺伝子の機能評価を行った。
【5】TCRの機能評価では、MHC/ペプチドテトラマーによるFACS解析が最も簡易的である。今回、哺乳類細胞株を用いて、膜型の1本鎖MHC/ペプチド（SCT）を可溶化型として発現させ、更にテトラマー化する方法を開発した。研究室レベルで、1週間程度で安価で大量のMHC/ペプチドテトラマーを作成できる方法を確立した。

今後の研究の推進方策

最終年度は以下の研究を推進する。
【1】T-ISAAC法の最適化: 我々は、T-ISAAC法の開発過程において、リンパ球チップ上でのペプチド刺激後の特異的T細胞の検出にIFN-γを用いていた。しかしながら、低頻度のペプチド特異的T細胞をより高感度に検出するために、シグナル/ノイズ比がより高く、低頻度の抗原特異的T細胞を効率よく検出できるサイトカイン等を検索する必要が生じてきた。そこで、平成31年度研究計画では、IFN-γ以外のサイトカイン（IL-2、TNF-α等）を産生する抗原特異的T細胞の検出およびそれらTCRのクローニングを行い、検出効率およびTCR親和性をIFN-γを指標に取得したTCRと比較評価する。モデル抗原としてEBウイルス抗原に反応するT細胞を持つ健常人末梢血単核球（PBMC）を用いてT-ISAAC法の最適化を行う。

【2】in vitro刺激でのペプチド濃度の最適化: 通常、がん抗原特異的T細胞は非常に低頻度であるため、未刺激の状態ではペプチド刺激のみでは検出することはできない。このためペプチドでin vitro刺激を行い、ペプチド特異的T細胞を増殖させる必要がある。これまでペプチド濃度は10 μg/mlを用いてきたが、刺激ペプチド濃度が高いと高親和性のT細胞はActivation-induced Cell death（AICD）により細胞死が誘導される可能性が指摘されている。高親和性のTCRを増殖させる至適ペプチド濃度は、TCRそれ自体の親和性に影響される可能性が考えられる。そこで、モデル抗原としてEBウイルス抗原に反応する健常人PBMCを種々のペプチド濃度で刺激し、TCR遺伝子のクローニングを行い、誘導効率および取得したTCRの親和性を評価する。

研究成果

• [雑誌論文] A novel and simple method to produce large amounts of recombinant soluble peptide/major histocompatibility complex monomers for analysis of antigen-specific human T cell receptors (2019)
  • 著者名/発表者名: Lyu Fulian、Ozawa Tatsuhiko、Hamana Hiroshi、Kobayashi Eiji、Muraguchi Atsushi、Kishi Hiroyuki
  • 雑誌名: New Biotechnology 巻: 49 ページ: 169～177
  • DOI: 10.1016/j.nbt.2018.11.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] A cloning and expression system to probe T-cell receptor specificity and assess functional avidity to neoantigens (2018)
  • 著者名/発表者名: Hu Z, Anandappa AJ, Sun J, Kim J, Leet DE, Bozym DJ, Chen C, Williams L, Shukla SA, Zhang W, Tabbaa D, Steelman S, Olive O, Livak KJ, Kishi H, Muraguchi A, Guleria I, Stevens J, Lane WJ, Burkhardt UE, Fritsch EF, Neuberg D, Ott PA, Keskin DB, Hacohen N, Wu CJ
  • 雑誌名: Blood 巻: 132 ページ: 1911～1921
  • DOI: 10.1182/blood-2018-04-843763
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Clonally Expanded Decidual Effector Regulatory T Cells Increase in Late Gestation of Normal Pregnancy, but Not in Preeclampsia, in Humans (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsuda Sayaka、Zhang Xiaoxin、Hamana Hiroshi、Shima Tomoko、Ushijima Akemi、Tsuda Kei、Muraguchi Atsushi、Kishi Hiroyuki、Saito Shigeru
  • 雑誌名: Frontiers in Immunology 巻: 9 ページ: 1934
  • DOI: 10.3389/fimmu.2018.01934
  • 査読あり
• [雑誌論文] Identification of Tumoricidal TCRs from Tumor-Infiltrating Lymphocytes by Single-Cell Analysis (2018)
  • 著者名/発表者名: Shitaoka Kiyomi、Hamana Hiroshi、Kishi Hiroyuki、Hayakawa Yoshihiro、Kobayashi Eiji、Sukegawa Kenta、Piao Xiuhong、Lyu Fulian、Nagata Takuya、Sugiyama Daisuke、Nishikawa Hiroyoshi、Tanemura Atsushi、Katayama Ichiro、Murahashi Mutsunori、Takamatsu Yasushi、Tani Kenzaburo、Ozawa Tatsuhiko、Muraguchi Atsushi
  • 雑誌名: Cancer Immunology Research 巻: 6 ページ: 378～388
  • DOI: 10.1158/2326-6066.CIR-17-0489
  • 査読あり
• [学会発表] Clonally expanded decidual effector Treg cells increase in late gestation of normal pregnancy, but not in preeclampsia in human. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsuda S, Kishi H, Xiaoxin Z, Shima T, Hamana H, Tsuda K, Ushijima A, Muraguchi A, Saito S.
  • 学会等名: The 38th Annual Meeting of the American Society for Reproductive Immunology
  • 国際学会
• [学会発表] T-ISAAC法を用いたペプチド特異的T細胞のTCRレパトア解析． (2018)
  • 著者名/発表者名: 小林栄治，村口 篤，岸 裕幸．
  • 学会等名: 第77回日本癌学会学術総会
• [学会発表] TILでクローナルなT細胞受容体は，腫瘍に対して細胞障害性を示し，腫瘍関連抗原を認識する． (2018)
  • 著者名/発表者名: 下岡清美，浜名 洋，小林栄治，早川芳弘，村口 篤，岸 裕幸．
  • 学会等名: 第77回日本癌学会学術総会
• [学会発表] ヒトの妊娠高血圧腎症と胎児染色体正常流産症例では脱落膜effector制御性T細胞のクローナリティと数が異なる． (2018)
  • 著者名/発表者名: 津田さやか，Zhang Xiaoxin，浜名 洋，島 友子，牛島明美，津田 桂，村口 篤，岸 裕幸，齋藤 滋．
  • 学会等名: 第39回日本妊娠高血圧学会学術集会
• [学会発表] 効率的な大腸癌免疫療法の確立に向けた腫瘍浸潤リンパ球レパートリー解析． (2018)
  • 著者名/発表者名: 祐川健太，浜名 洋，下岡清美，小林栄治，北條荘三，奧村知之，長田拓哉，村口 篤，岸 裕幸，藤井 努．
  • 学会等名: 第29回日本消化器癌発生学会総会
• [学会発表] 制御性T細胞のsingle-cell TCRレパートリー解析により示唆された流産と妊娠高血圧腎症の免疫学的病態の相違． (2018)
  • 著者名/発表者名: 津田さやか，チャン シャオシン，浜名 洋，島 友子，牛島明美，津田 桂，村口 篤，岸 裕幸，齋藤 滋．
  • 学会等名: 第33回日本生殖免疫学会総会・学術集会
• [学会発表] 酵母表面ディスプレイ法を用いたTCRの抗原ペプチド/MHCライブラリーの作製とそのスクリーニング． (2018)
  • 著者名/発表者名: 小澤龍彦，大貫 燿，浜名 洋，小林栄治，呂 福蓮，村口 篤，岸 裕幸．
  • 学会等名: 第41回日本分子生物学会年会
• [学会発表] TCR repertoire analysis of peptide-specific T cells using immunospot array assay on a chip (T-ISAAC) technology. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kobayashi E, Ozawa T, Hamana H, Shitaoka K, Muraguchi A, Kishi H.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] A rapid and simple protocol for cDNA cloning of tumor antigen-specific TCR. (2018)
  • 著者名/発表者名: Hamana H, Ozawa T, Kobayashi E, Shitaoka K, Muraguchi A, Kishi H.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] The development of antigen detection system using yeast surface display library. (2018)
  • 著者名/発表者名: Ohnuki Y, Ozawa T, Hamana H, Kobayashi E, Lyu F, Muraguchi A, Kishi H.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] Tumor infiltrating lymphocyte repertoire analysis of colon cancer. (2018)
  • 著者名/発表者名: Sukegawa K, Hamana H, Shitaoka K, Kobayashi E, Saeki S, Nagata T, Fujii T, Muraguchi A, Kishi H.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] Clonally expanded populations of cytotoxic T cell in tumor infiltrated lymphocyte and peripheral blood in uterine endometrial cancer. (2018)
  • 著者名/発表者名: Tsuda K, Kishi H, Nakashima A, Hamana H, Tsuda S, Shima T, Shitaoka K, Kobayashi E, Ozawa T, Muraguchi A, Saito S.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会
• [学会発表] Development of TCR-antigen identification system using “cis-interaction” of TCR and peptide/MHC complex on a T cell. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yamaguchi S, Kishi H, Shitaoka K, Hamana H, Kobayashi E, Ozawa T, Muraguchi A.
  • 学会等名: 第47回日本免疫学会学術集会