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2018 年度 実績報告書

マウスiPS-卵母細胞培養系を用いた感染性流早産患者の母体遺伝的背景の解析

研究課題

研究課題/領域番号 17H04237
研究機関地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所)

研究代表者

柳原 格  地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 免疫部門, 部長 (60314415)

研究分担者 林 克彦  九州大学, 医学研究院, 教授 (20287486)
西海 史子  地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 免疫部門, 流動研究員 (60599596)
呉 恒寧  地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 免疫部門, 研究技術員 (80648139)
吉村 芳修  地方独立行政法人大阪府立病院機構大阪母子医療センター(研究所), 免疫部門, 研究員 (90771197)
研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2020-03-31
キーワード再構築卵母細胞 / 人工卵巣 / 始原生殖細胞様細胞 / ウレアプラズマ / 精子機能
研究実績の概要

ES細胞から分化誘導した始原生殖細胞様細胞をソーティングし、生殖腺体細胞と混合し、人工卵巣の作成を行い卵母細胞の分化過程を顕微鏡下で確認するところまで進んだ。次の段階としては、ウレアプラズマ感染精子を用いて、卵母細胞再構築系で作成した卵母細胞と受精を行う。まず、ウレアプラズマ感染が精子運動機能と関連するのか、否かの双方の意見があり、未だ結論が出ていない。そこで、まずマウス精子に対するウレアプラズマ感染の影響を調べた。ICRマウス精子に、様々な菌量のウレアプラズマ(OMC-P162株)を感染させた。運動性の評価は、Swim-up法並びにSMASを用いて解析した。精子運動性は、感染1時間~3時間で有意に低下した。この低下は菌量依存的であった。高濃度のウレアプラズマを用いた場合は、特に不動精子数が有意に増加した。一方、直進速度、曲線速度、直進性、頭部振幅、頭部振動数には有意な差が認められなかった。電顕及び共焦点レーザー顕微鏡観察の結果、ウレアプラズマはマウス精子の頭部及び中間部に多く付着あるいは侵入していることが示されたが、一部は尾部にも付着している像が観察された。特に高濃度のウレアプラズマを感染させた場合には、多数の精子が凝集塊を形成した。一方、非病原性の大腸菌(JM109)は、マウス精子に付着せず、精子の形態などにも影響しなかった。これらの事から、ウレアプラズマは濃度依存的に精子機能に影響を与えることが示された。これまで報告された男性不妊とウレアプラズマに関する実験系では、ウレアプラズマ濃度の調整が殆どなされておらず、安定した結果が得られなかったと考えられた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

卵母細胞再構築系は、ほぼ研究室内に再現できた。現段階の問題点としては、始原生殖細胞様細胞の分離に余計に2時間以上かかっており、その時間を短縮する事ができれば、より効率的に卵母細胞への分化が可能であると考えている。我々の過去の流産胎盤の検討では、妊娠13週の胎盤からもウレアプラズマが検出されており、かなり早期から感染のリスクは有ると思われるが、卵巣内で既に感染しているのか、否かについての検討はこれまでのところ見当たらない。我々はフィリピン大学と共同で卵巣癌及びコントロールの摘出卵巣におけるウレアプラズマの検出を行った。その結果、フィリピン人の卵巣癌患者で化学療法が奏功した摘出卵巣からウレアプラズマ核酸が検出された(4/8)。正常コントロールとは異なる癌病変である為、今後の検討が必要であるが、ウレアプラズマは精子に感染するのみならず、受精前に卵巣内(卵母細胞)に達している可能性は残されている。
一方、母体の遺伝的背景に関しては、これまで絞り込みを行った候補遺伝子のCRISPR-Cas9システムを用いた遺伝子破壊を行う為、まずはHeLa細胞を用いた遺伝子破壊を行った。シーケンスで複数の当該遺伝子破壊株を確認することができた。

今後の研究の推進方策

卵母細胞再構築系を用いてより多くの卵母細胞の作成を行う。ウレアプラズマ感染精子を用いたIVFを行い、その後胚盤胞までの分化について顕微鏡下にて観察し、受精率や、その後の受精卵のグレーディングを評価し不妊との関連を明らかにする。男性不妊との関連については、今年度の結果でウレアプラズマは量依存的に精子の運動機能を抑制したので、さらに精子における活性酸素種の産生や、より詳細な電顕等の画像解析また、動画の解析を行い明らかにする。人工卵巣における、ウレアプラズマ感染がその後の卵母細胞の発生に影響するのか否か、まずは細胞の形態、卵母細胞の成熟などを指標に解析を始める。以前の解析で、ウレアプラズマは宿主細胞内に侵入する事を見出している。再構築した人工卵巣培養系にウレアプラズマを感染させた場合、卵母細胞内に侵入するのか、あるいは周囲の卵丘細胞などにのみ感染しうるのか実験的では有るが検討する。
母体の遺伝的背景また、卵母細胞再構成系で作成した卵母細胞における遺伝子破壊を試みる。まずはMII卵母細胞に、候補遺伝子の破壊を目的としたCRISPR-Cas9発現ベクターをマイクロインジェクションし、その後IVFにより受精率を調査し、受精卵の発生を観察する。我々は現在20遺伝子程度を候補として抽出しており、これらの機能解析を順次進めることで各遺伝子の受精、あるいは初期発生における役割を比較検討していく。

  • 研究成果

    (14件)

すべて 2019 2018 その他

すべて 国際共同研究 (2件) 雑誌論文 (3件) (うち国際共著 3件、 査読あり 3件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (8件) 備考 (1件)

  • [国際共同研究] フィリピン大学マニラ校(フィリピン)

    • 国名
      フィリピン
    • 外国機関名
      フィリピン大学マニラ校
  • [国際共同研究] ソフィアテクニカル大学(ブルガリア)

    • 国名
      ブルガリア
    • 外国機関名
      ソフィアテクニカル大学
  • [雑誌論文] Impact of maternal methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism on intervillous and decidual pathology with pregnancy loss.2019

    • 著者名/発表者名
      Mehandjiev TR, Tenno NM, Yanagihara I, et al.,
    • 雑誌名

      J Obstet Gynaecol Res

      巻: 45 ページ: 78-85

    • DOI

      10.1111/jog.13798

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Fatal overwhelming postsplenectomy due to Streptococcus pneumoniae serotype 10A with atypical polysaccharide capsule in a patient with chromosome 22q11.2 deletion syndrome: A case report. J Infect Chemother2019

    • 著者名/発表者名
      Matsuoka K, Yanagihara I, Takeuchi M, et al.
    • 雑誌名

      J Infect Chemother

      巻: 25 ページ: 192-196

    • DOI

      org/10.1016/j.jiac.2018.07.015

    • 査読あり / 国際共著
  • [雑誌論文] Type II restriction modification system in Ureaplasma parvum OMC-P162 strain.2018

    • 著者名/発表者名
      Wu HN, Nakura Y, Yanagihara I et al.,
    • 雑誌名

      PLOS One

      巻: 13 ページ: e0205328

    • DOI

      org/10.1371/journal.pone.0205328

    • 査読あり / オープンアクセス / 国際共著
  • [学会発表] トキソプラズマ国内分離株のブタにおける病原性2019

    • 著者名/発表者名
      谷口裕二、柳原格、名倉由起子、松崎素道、福本隼平、喜屋武向子、鬼頭克也、永宗喜三郎、高島康弘
    • 学会等名
      第88回日本寄生虫学会
  • [学会発表] Pathogenesis of Ureaplasma infection in perinatal and neonatal medicine2018

    • 著者名/発表者名
      Michinobu Yoshimura, Fumiko Nishiumi, Heng Ning Wu, Yukiko Nakura, Itaru Yanagihara
    • 学会等名
      The Joint Congress of the 7th Meeting of the Asian Organization for Mycoplasmology (AOM) and the 45th Meeting of Japanese Society of Mycoplasmology (JSM)
  • [学会発表] TypeⅡrestriction modification system in Ureaplasma parvum OMC-P162 strain2018

    • 著者名/発表者名
      Heng Ning Wu, Yukiko Nakura, Michinobu Yoshimura, Itaru Yanagihara
    • 学会等名
      The Joint Congress of the 7th Meeting of the Asian Organization for Mycoplasmology (AOM) and the 45th Meeting of Japanese Society of Mycoplasmology (JSM)
  • [学会発表] 高病原性オウム病病原体の遺伝子解析2018

    • 著者名/発表者名
      名倉由起子、清水可奈子、河原和美、竹内真、吉田好雄、柳原格
    • 学会等名
      第54回日本周産期・新生児医学会学術集会
  • [学会発表] Screening of DNA aptamers against synthetic lipopeptide UPM-1for Ureaplasma detection2018

    • 著者名/発表者名
      Jeany Meza,Maui Nishio, Kaori Tsukakoshi, Itaru Yanagihara, Kenichiro Hata, Kazuhiko Nakahashi, Kazunori Ikebukuro
    • 学会等名
      日本核酸化学会
  • [学会発表] 気管内ウレアプラズマ(U)検出に母体および児へのAZM投与が及ぼす影響について2018

    • 著者名/発表者名
      江頭政和、冨野広道、川端祥平、七條了宣、飯田千晶、江頭智子、水上朋子、高柳俊光、柳原格
    • 学会等名
      第63回日本新生児育成医学会
  • [学会発表] 母児へのウレアプラズマ(U)介入前後における超早産児の臨床像の比較検討2018

    • 著者名/発表者名
      江頭政和、冨野広道、川端祥平、七條了宣、飯田千晶、江頭智子、水上朋子、高柳俊光、柳原格
    • 学会等名
      第63回日本新生児育成医学会
  • [学会発表] Next-generation sequencing-based analysis of reverse transcriptase fidelity2018

    • 著者名/発表者名
      Kiyoshi Yasukawa, Hiroyuki Okano, Misato Baba, Kei Iida, Ryota Hidese, Itaru Yanagihara, Kenji Kojima, Teisuke Takita, Shinsuke Fijiwara
    • 学会等名
      BICON
  • [備考] 大阪母子医療センター研究所免疫部門

    • URL

      https://www.wch.opho.jp/research/developmental/index.html

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公開日: 2019-12-27  

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