| 研究課題/領域番号 |
17H04310
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
齋藤 琢 東京大学, 医学部附属病院, 准教授 (30456107)
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| 研究分担者 |
小林 寛 東京大学, 医学部附属病院, 助教 (20407951)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 整形外科学 |
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| 研究実績の概要 |
まず最表層細胞、中間層・深層細胞のサブセット解析として、Prg4-GFP-CreERT2マウスの膝関節からコラゲナーゼ、トリプシンなどのタンパク分解酵素処理を組み合わせ、初代培養細胞を採取し、FACS(fluorescence activated cell sorting)にてPrg4陽性、陰性の細胞に分離した。次にPrg4陽性細胞群についてシングルセル解析を行い、複数のクラスターに分類されることは判明したが、各群でFASCに堪えうる特異的なマーカーを同定することは困難であった。その原因として、現行のシングルセル解析では発現コピー数が極端に大きい遺伝子しか検出できないことが考えられた。そこで培養増幅を十分に行ってからRNAシーケンスを行い、マーカー遺伝子を3つ選出した。そのうちの1つについてはCreマウスを作出し、Rosa26-tdTomatoと交配させて検討したが、部位特異的な組み換えが確認された。また発現遺伝子の差異から、Wntシグナル、Notchシグナルのほか、NF-kappaBシグナルが最表層細胞の表現型の決定に重要であることが確認され、それぞれのfloxマウスをPrg4-GFP-CreERT2マウスと交配させ、最表層特異的な機能喪失マウスを作出し、検討を行っている。またWnt、Notchについては表層特異的なノックアウトによって関節機能に関して強い表現型が得られた。またin vitroでもそれぞれの遺伝子の機能解析を開始しており、最表層細胞と中間層・深層細胞の制御にどのように関係するかを、細胞増殖、未分化性の維持、成熟、肥大化など分化過程、細胞老化など現象ごとに解析を実施している最中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
層特異的なCreマウスも新たに作出でき、また層特異的シグナル解析も順調に進行しているなど、ほぼ計画通りの進捗である。
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| 今後の研究の推進方策 |
セルトラッキングによる関節軟骨細胞のライフサイクルの検証として、作出したCreマウスとRosa26-tdTomatoなどのレポーターマウスと交配させた系統につき、引き続きセルトラッキングで追跡する。またRosa26-DTAマウスと交配させて細胞死を誘導し、当該細胞の機能喪失実験を継続する。Progenitorの細胞培養系と関節軟骨細胞への分化系の確立についても継続して実験を行う。特にin vivoで表現型が得られたWntシグナル、Notchシグナルの関与について重点的に検討を行う。この2つのシグナルについては引き続き生体レベルでの解析も深めていく。
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