| 研究課題/領域番号 |
17H04368
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
豊澤 悟 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (30243249)
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| 研究分担者 |
阿部 真土 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (40448105)
保田 英洋 大阪大学, 工学研究科, 教授 (60210259)
宇佐美 悠 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (80444579)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 骨細胞 / Dmp1 / Fam20C / リン酸化 / 石灰化 |
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| 研究実績の概要 |
細胞外基質であるDmp1は、骨芽細胞では発現せず、骨基質に埋まった骨細胞で特異的に発現する。発現したDmp1は、翻訳後修飾の過程で２つに切断され、NH2-端(N端)断片はプロテオグリカンと結合して骨小腔周囲に分布し、COOH-端(C端)断片はキナーゼ(Fam20C)によってリン酸化されて骨細管壁に分布し、骨細胞機能に関与すると考えられる。このように、N端断片とC端断片の分布と翻訳後修飾の違いから、骨細胞機能における両断片の果たす役割は異なると思われるが、その役割はよく分かっていない。
リン酸化Dmp1の役割については、Fam20C過剰発現マウスの骨組織を用いて解析を行い、リン酸化セリン抗体を用いた形態学的解析ではDmp1のリン酸化が示唆された。しかし、未脱灰骨サンプルから、亜鉛を用いて補足したリン酸化抽出物の網羅的リン酸化解析では、Dmp1以外の多数の分泌蛋白質のリン酸化亢進が確認されるにも関わらず、リン酸化Dmp1は全く検出されなかったので、脱灰骨サンプルの調整を行って、網羅的リン酸化解析を行う準備をした。
また、Dmp1の細胞内輸送を制御する輸送シグナル配列の同定を試みるため、①Dmp1全長配列のN端に赤色蛍光、C端に緑色蛍光を付けた発現ベクター、②全長配列を段階的に短くし、N端に赤色蛍光、C端に緑色蛍光を付けた２つのディレーション変異体発現ベクター、③N端に赤色蛍光を付けたN端断片のみのディレーション変異体発現ベクターを作製した。まず、Dmp1全長配列発現ベクターを、石灰化培地で培養しているMC3T3-E1細胞に遺伝子導入し、１日後に赤色蛍光と緑色蛍光の発色を確認した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
Fam20C過剰発現マウスの骨組織におけるDmp1のリン酸化が、未脱灰骨サンプルを用いた網羅的リン酸化解析では検出できず、脱灰骨サンプルの調整を行う等、リン酸化Dmp1の検出方法に試行錯誤している。また、Dmp1の分泌経路の超微構造解析は、未脱灰骨の超薄切片作製に大きな課題があり、培養細胞の超微構造解析に変更した。
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| 今後の研究の推進方策 |
Fam20C過剰発現マウスの骨組織におけるDmp1のリン酸化の生化学的証明は、未脱灰骨ではDmp1がハイドロキシアパタイトと結合して抽出できない可能性から、脱灰骨サンプルを用いて網羅的リン酸化解析を行う。Dmp1の分泌経路の超微構造解析は、未脱灰骨ではなく、培養骨細胞を用いて研究を進める。また、作製したDmp1変異体を骨細胞に遺伝子導入して、赤色蛍光と緑色蛍光の細胞内分布から、Dmp1の細胞内輸送を制御する輸送シグナル配列の同定を試みる。
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