| 研究課題/領域番号 |
17H04379
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| 研究機関 | 長崎大学 |
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研究代表者 |
筑波 隆幸 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (30264055)
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| 研究分担者 |
坂井 詠子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (10176612)
岡元 邦彰 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (10311846)
門脇 知子 (筑波知子) 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (70336080)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 免疫細胞 |
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| 研究実績の概要 |
免疫細胞では細胞内部で精密な膜輸送や分泌機構が機能している。我々は独自の研究から、破骨細胞の分化過程で増大する遺伝子Rab44を発見した。Rab44遺伝子をノックダウンした破骨細胞は活性化・巨大化し、逆にRab44を過剰発現した細胞では活性化が抑制され、エンドゾームの粒子数が増大した。従って、Rab44は細胞形態と膜輸送の制御を行っている遺伝子であると予測される。本研究の目的は、我々が独自に見出した新規遺伝子Rab44の機能を破骨細胞のみならず免疫系細胞を用いて明らかにする事である。
１）破骨細胞での新規Rab44遺伝子の発見：破骨細胞は骨を分解する多核細胞であり、骨吸収時には“分泌リソソーム”を骨面に放出する。分泌リソソームはミネラルを溶解するプロトンや有機質成分を分解するタンパク質分解酵素が含まれる。我々は破骨細胞におけるリソソーム機能を制御する新規遺伝子を同定するため、分化前のマクロファージと破骨細胞とのmRNAを抽出し、逆転写～DNAマイクロアレーを行なった。発現レベルに差異のあった遺伝子を分類し、膜タンパク質群と膜輸送調節因子群に分けた。この方法で全く論文報告されていないRab44遺伝子が同定できた。
２）破骨細胞におけるRab44遺伝子ノックダウンの解析：Rab44遺伝子をマクロファージから破骨細胞に分化する間、siRNAでノックダウンしてTRAP染色を行なった。Rab44ノックダウン破骨細胞は細胞同士の融合が活発になっており、巨大化・多核化した。さらにRab44ノックダウン破骨細胞は殆どのマーカー遺伝子の発現レベルが上昇していたことなどからRab44が欠損すると破骨細胞が活性化することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
１）Rab44結合タンパク質の同定：昨年度と同様に結合タンパク質の解析を行っている。一般的にRabタンパク質には多くのエフェクタータンパク質が結合して機能する。そこでRab44タンパク質に結合するタンパクを同定を試みた。まず内在性タンパク質について免疫沈降法を行った後、質量分析法を用いて相互作用する分子を同定した。結合する可能性が示された分子は再度もう一方に分子の抗体を用いて免疫沈降法で確認した。次にRab44過剰発現細胞を用いて、Rab44プルダウンアッセイを行い、結合タンパク質を質量分析法により同定した。現在まで少なくとも3つの分子が結合していることが明らかとなっている。ここでは詳細は省略するがいずれもあまり解析が進んでいないタンパク質のようである。
２）Rab44制御による分泌のバイオイメージング
Rab44により細胞内での膜輸送機構や分泌機構に特徴が観察されると予想していた。そこで蛍光顕微鏡を用いてリソソーム酵素の細胞内輸送機構や分泌する様子のバイオイメージングを試みた。そのためにC末端にモノマーRedFluorescentProtein（mRFP）を結合させたニューロペプチダーゼY（NPY-mRFP ）を入手しアデノウイルスベクターにてRab44欠損破骨細胞あるいはマスト細胞と正常細胞にそれぞれ発現させた。発現させた細胞をタイムラプス蛍光顕微鏡あるいは全反射蛍光顕微鏡で観察している。
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| 今後の研究の推進方策 |
１）Rab44遺伝子欠損マウスの作成：本遺伝子の生体内での機能を探るべく遺伝子欠損マウスを作製し、解析を試みる。作製は既に理化学研究所生体ゲノム工学研究チームに協力を依頼し、CRISPR/Cas9による迅速な作製方法で実行した。ホモマウスも順調に増加している。現在個体の変化の観察と個体から免疫細胞を取り出し、野生型と欠損マウス由来の細胞での比較解析を行っている。
２）Rab44遺伝子欠損マウスでの骨組織・骨代謝の変化：Rab44は破骨細胞では発現しているが、骨芽細胞では発現していない。Rab44ノックダウン破骨細胞が活性化していることから、Rab44欠損マウスは骨粗鬆症を呈する可能性が考えられる。そこで胎生期マウスあるいは生後数日後のマウスの透明骨格標本を作製する。アルシアンブルー染色で青色に染まった軟骨組織とアリザリンレッドで赤色に染まった石灰化硬組織の範囲を比較し、マウス個体レベルでの硬骨形成の比較を行う。さらに成長したマウスの大腿骨、椎骨等のX線解析を行い、固定後脱灰パラフィン切片や非脱灰樹脂切片を作製し、HE染色、TRAP染色を行い、骨形成を比較する。またカルセインを2回投与し、非脱灰樹脂標本を作製し骨組織形態計測を行う。またμCT解析により骨量、海綿骨数、海綿骨厚を測定する。
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