| 研究課題/領域番号 |
17H04379
|
|---|
| 研究機関 | 長崎大学 |
|---|
研究代表者 |
筑波 隆幸 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 教授 (30264055)
|
|---|
| 研究分担者 |
坂井 詠子 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 助教 (10176612)
岡元 邦彰 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 教授 (10311846)
門脇 知子 (筑波知子) 長崎大学, 医歯薬学総合研究科(歯学系), 准教授 (70336080)
|
|---|
| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| キーワード | 免疫系細胞 / Rabタンパク質 / Rab44 |
|---|
| 研究実績の概要 |
免疫細胞では細胞内部で精密な膜輸送や分泌機構が機能している。我々は独自の研究から、破骨細胞の分化過程で増大する遺伝子Rab44を発見した。Rab44遺伝子をノックダウンした破骨細胞は活性化・巨大化し、逆にRab44を過剰発現した細胞では活性化が抑制され、エンドゾームの粒子数が増大した。従って、Rab44は細胞形態と膜輸送の制御を行っている遺伝子であると予測される。本研究の目的は、我々が独自に見出した新規遺伝子Rab44の機能を破骨細胞のみならず免疫系細胞を用いて明らかにする事である。
1) Rab44結合タンパク質の同定
一般的にRabタンパク質には多くのエフェクタータンパク質が結合して機能する。そこでRab44タンパク質に結合するタンパクを同定した。まず内在性タンパク質について免疫沈降法を行った後、質量分析法を用いて相互作用する分子を同定した。結合する可能性が示された分子は再度もう一方に分子の抗体を用いて免疫沈降法で確認した。次にRab44過剰発現細胞を用いて、Rab44プルダウンアッセイを行い、結合タンパク質を質量分析法により同定する。同様に恒常的に活性型であるドミナント・アクティブ型、恒常的に不活性型であるドミナント・ネガティブ型を発現させて、結合タンパク質の違いがあるかどうかを解析する。
2) Rab44遺伝子欠損マウスの作成
本遺伝子の生体内での機能を探るべく遺伝子欠損マウスを作製し、解析を試みる。作製は既に理化学研究所生体ゲノム工学研究チームに協力を依頼し、CRISPR/Cas9による迅速な作製方法で実行している。受精卵に注入したsgRNA/Cas9 が標的遺伝子の片方もしくは両方のアレルを切断すると変異マウスが得られる。両アレルが破壊された場合には，欠損ホモマウスとなる。卵割したのちにCas9が標的配列を切断するとモザイクマウスが生まれるため区別できる。現在、正常に発育し、解析を行っている。
|
| 現在までの達成度 (段落) |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
|
| 今後の研究の推進方策 |
令和元年度が最終年度であるため、記入しない。
|
