| 研究課題/領域番号 |
17H04383
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
今里 聡 大阪大学, 歯学研究科, 教授 (80243244)
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| 研究分担者 |
佐々木 淳一 大阪大学, 歯学研究科, 講師 (50530490)
松崎 典弥 大阪大学, 工学研究科, 准教授 (00419467)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 再生歯学 / 歯髄再生療法 / 組織工学 / 生体材料学 / 細胞集合体 |
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| 研究実績の概要 |
平成30年度では、歯髄幹細胞（DPSC）の集合体を血管内皮細胞へ分化誘導することによる血管系細胞への分化過程について検討した。細胞集合体を血管内皮細胞分化誘導培地（VE-dif）を用いて培養を行うと、培養20日目において、血管内皮細胞分化マーカーであるSMA陽性細胞からなる明瞭な網目状構造が形成されていることが分かった。次に、細胞集合体内に形成された網目状構造について詳細な検討を行うことを目的として、VE-difで20日間培養した細胞集合体に蛍光色素を含有したデキストラン粒子を流し込んだところ、細胞集合体に形成された網目状構造に一致するデキストラン粒子の沈着を認めた。このことは、SMA陽性細胞によって形成された網目状構造が管腔様構造であることを示しており、細胞集合体内で血管内皮細胞に分化したDPSCが毛細血管様の構造を形成しているものと考えられた。
次に、細胞集合体を構成するDPSCの血管系細胞への分化過程について検討することを目的として、細胞集合体外層、あるいは内層を構成する細胞を取り出し、CXCL1やVEGFAなどの血管内皮細胞分化マーカー、および幹細胞マーカーであるNanogのmRNAの発現をリアルタイムPCRによって検討した。その結果、最大20日間の培養期間において、CXCL1とVEGFAは、集合体外層を構成するDPSCで内層の細胞と比較して有意に多く発現していることが分かった。一方、NanogのmRNA発現量は、培養10日目までにおいて集合体内層の細胞で有意に多く発現していたが、培養20日目では、内層と外層の細胞で有意差はみられなくなった。
以上のことから、DPSCからなる細胞集合体をVE-difで培養することで、集合体外層のDPSCが血管内皮細胞に分化し、毛細血管様構造を形成したことが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
平成30年度に得られた結果から、歯髄幹細胞（DPSC）からなる細胞集合体を血管内皮細胞誘導培地（VE-dif）で培養することで、集合体内に毛細血管様の網目状構造物を形成できることが示された。さらに、集合体外層のDPSCは、VE-difで培養することで血管内皮細胞分化マーカーを高発現する血管内皮細胞様細胞に分化することを明らかにした。これらの結果は、DPSCを用いて作製した細胞集合体をVE-difで培養することで、血管網をもった歯髄様組織を創製できる可能性を示している。以上のことから本研究は、おおむね順調に進展していると判断できる。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞集合体を構成する歯髄幹細胞を神経細胞へ分化誘導することで集合体内に構築される神経網構造の形成過程を観察し、また神経細胞へ分化した歯髄幹細胞の分布を評価する。さらに、血管網と神経網の両者を併せ持つ高次機能型歯髄様組織を作製し、その歯髄再生能を評価する。具体的には、以下の研究計画を実施する。
１．細胞集合体内における神経網構造の形成過程の評価：歯髄幹細胞集合体を神経細胞分化誘導培地を用いて最大20日間培養後、パラフィン包埋薄切切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン（HE）染色を行うことで神経網が形成される過程を経時的に観察する。神経細胞へ分化した歯髄幹細胞の分布については、細胞集合体外層、あるいは内層を構成する細胞を取り出し、NestinやGFAPなどの神経細胞分化マーカー、および幹細胞マーカーであるNanogのmRNAの発現をリアルタイムPCRによって検討する。
２．血管網と神経網の両者を併せ持つ歯髄様組織の構築：血管網と神経網を併せ持った高次機能型歯髄様組織をin vitroで作製する技術を確立することを目的として、作製した歯髄幹細胞集合体に対して血管内皮細胞と神経細胞への段階的分化誘導を行う。作製した人工歯髄様組織内における分化した各細胞の分布については，各細胞分化マーカーの多重免疫蛍光染色により評価し、さらに、各細胞の割合をフローサイトメトリーにて定量する。また、作製した人工歯髄様組織内の血管網機能はデキストラン粒子を用いる手法で、神経機能はカルシウムイメージング法を行うことによって評価する。これらの検討を通じて、血管網と神経網をもった高次機能型歯髄様組織が歯髄再生医療に有用であるかを明らかにする。
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