|
本研究では、標的となるタンパク質・測定対象に与える影響を最小限にしたタグペプチドによるタンパク質標識を目指し、新奇なCross-linked Protein-derived Cofactors (CPDC)を持ったペプチドやタンパク質の開発を行ってきた。金属結合ペプチドやタンパク質を用いて、その系中で金属による酸化的自己修飾反応を制御し、翻訳後化学修飾を誘起して自発的に形成される新たなクロモフォア、フルオロフォアを持った人工タグペプチドやタンパク質の検索を行う。金属結合部位として銅に対して選択的に結合するATCUN(Amino Terminal Cu(II)- and Ni(II)-binding Motif)配列(X1-X2-His)や金属結合タンパク質に着目した。MBPタンパク質などのN末端にこれら配列を結合させ、X1-X2の配列を変えた変異体とNiセファロースを用いてその結合量から金属結合能を評価した。加えて小分子タンパク質の内部で生じるCPDCについても検討を行い、より精緻な設計方構築を目指し、その反応機構に焦点を当てた研究を行った。MBPタンパク質のN末端では様々な金属結合配列が観測された。単純に予想されるように、X1-X2の配列にヒスチジンやアスパラギン酸などの配位性アミノ酸が見られるものが多かったものの、配位性でないアミノ酸のジペプチドでも結合が見られた。また、金属結合タンパク質中ではCPDC近傍のアミノ酸残基に部位飽和変異誘発を利用してより修飾効率の良い変異体を獲得し、構造などの評価により、その形成メカニズムを検討した。その結果、近傍のアミノ酸同士の相互作用によってコンフォーマー比率が変化し、形成効率が変化することが示唆された。
|
