| 研究課題/領域番号 |
17H04993
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| 研究機関 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 |
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研究代表者 |
宮岡 佑一郎 公益財団法人東京都医学総合研究所, 生体分子先端研究分野, プロジェクトリーダー (20549521)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | ゲノム編集 / HDR / NHEJ / Cas9改変体 / ノックイン / 相同組換え / 非相同末端結合 |
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| 研究実績の概要 |
CRISPR/Cas9は、標的配列特異的なgRNAにヌクレアーゼであるCas9が誘導され、標的ゲノムDNAが切断される。切断されたDNA修復反応には、相同組換え (HR)、非相同性末端結合(NHEJ)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)などがある。このうち、組換えを介してドナーDNA配列通りに編集が起こるHRは、正確で自在なゲノム編集を達成するために非常に有益である。しかし、その頻度はNHEJやMMEJに比べて極めて低い場合が多い。我々は、改変したCas9やgRNAの使用が、HR頻度を亢進することを見出していたが、今年度はその特性についてさらに詳細な解析を進めた。
まず、改変型Cas9として既に報告のあるeSpCas9(1.1)、SpCas9-HF1に、DNAとの相互作用を変化させる変異を追加で導入した改変体、さらに、いくつかの変異を修正した改変体も作製し、DNAとの相互作用様式の変化強度を調節した一連の改変体シリーズの活性を検討した。また、gRNAについても標準より長いものと短いもの、さらにグアニンだけでなく他のヌクレオチドを追加したものを作製し、これらのgRNAシリーズの活性を検討した。その結果、HR活性を亢進し、NHEJ/MMEJ活性を抑制するには、至適な標的ゲノムDNAとCas9-gRNA複合体の相互作用強度が存在することが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
正確なゲノム編集を達成するためには、HR頻度を高め、NHEJ/MMEJ頻度を抑制する必要がある。今年度に得られた、HR活性を亢進し、NHEJ/MMEJ活性を抑制するために、至適なゲノムDNAとCas9-gRNA複合体の相互作用強度が存在するという発見は、今後のさらなるCRISPR/Cas9ゲノム編集技術の発展に有益であると考えられるため。
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| 今後の研究の推進方策 |
改変型Cas9やgRNAの利用に加えて、ゲノムDNA修復因子とCas9の融合などの様々なアプローチによって、さらにHR頻度の向上とNHEJ/MMEJ頻度の抑制を目指す。 Cas9-gRNA複合体のゲノムDNAへの結合様式の相違が、HR活性とNHEJ/MMEJ活性のバランスを変化させる分子機構の解明を目指し、得られた知見をさらなる改良につなげる。また、得られた知見をCas9だけでなく、Cas9 nickaseにも応用する。
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