| 研究課題/領域番号 |
17H04994
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
西田 敬二 神戸大学, 先端バイオ工学研究センター, 教授 (10620338)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | 合成生物学 / ゲノム編集 / Target-AID / 塩基編集 / Base editing |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、標的とする任意のDNA配列を切らずに直接書き換えることが出来るゲノム編集技術として、これまでに達成できた、シチジン脱アミノ化反応を用いる「切らないゲノム編集C型」に加えて、より難易度の高い「切らないゲノム編集A・T型」を実現すべく、DNAアデニン・チミン変換型ゲノム編集人工酵素等を構造的アプローチと進化工学を駆使して創出し、新たなゲノム編集技術として確立することが本研究計画の目的である。これによってすべてのDNA塩基の自在な書き換えを実現し、生命科学全般の基盤となる革新的なツールを提供する。
本年度は、昨年度に獲得したチミンから別の塩基への変換が可能になる脱塩基酵素について、その効率の向上を目指した進化工学的アプローチに着手した。具体的には、立体構造から予測される基質塩基およびDNAに相互作用するアミノ酸部位を複数選び出し、その相互作用を強化すべく種々のアミノ酸置換を生じるような変異を導入するコンストラクトを作成し、それら変異の組み合わせについてスクリーニングを行う。酵母のCan1遺伝子のネガティブスクリーニングの系を利用し、より高頻度に変異を誘発できるクローンを選抜し、シーケンス解析によって複数のアミノ酸置換を同定した。しかしながら、得られた置換体について再び形質転換して効率を検証したところ、有意に変異率を上昇させるものは見出されなかった。そこで改めて、現在母体として用いている酵母由来の脱塩基酵素と他の生物由来のオルソログの配列と構造を比較して、不要と思われるN末端のドメインの除去など、活性を阻害している可能性のある要素の検証をすべく設計を行った。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
当初の計画として進化工学による酵素活性の高効率化を目指していたが、現段階では有力な変異体の獲得には至っておらず、アプローチの変更を検討しているため。
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| 今後の研究の推進方策 |
酵素の種間における構造比較によってより合理的な設計思想を導入することとし、また新たな母体となる新規酵素の探索と試験も行う。
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