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2019 年度 実績報告書

神経変性疾患の試験管内再現とその解析

研究課題

研究課題/領域番号 17H04995
研究機関兵庫県立大学

研究代表者

町田 幸大  兵庫県立大学, 工学研究科, 助教 (20553093)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2021-03-31
キーワードバイオテクノロジー / 脳神経疾患 / 生体分子
研究実績の概要

本年度は、CAGリピートのrepeat-associated non-ATG 翻訳(RAN翻訳)について、翻訳産物として得られるポリグルタミン:polyQ、ポリセリン:polyS、ポリアラニン:polyAのそれぞれの合成割合と凝集性を3種類のタグ(ポリグルタミンならばMYCタグ、ポリセリンならばFLAGタグ、ポリアラニンならばHAタグ)を利用して区別するためのPlasmidを構築し、293T細胞とHeLa細胞由来無細胞タンパク質合成系で解析するための実験を進めてきた。その結果、293T細胞ではポリグルタミン<ポリセリン<ポリアラニンの順に凝集性が高いことが明らかになった。一方、HeLa細胞由来無細胞タンパク質合成系でも同様の結果が得られたが、ポリセリンの凝集性については293T細胞よりも大幅に緩和されていた。HeLa細胞由来無細胞タンパク質合成系は細胞膜を含まない合成システムなので、ポリセリンは細胞内では、細胞膜と相互作用して凝集性が高くなっていることが示唆された。さらに、遺伝子上のどの位置からRNA翻訳が開始するかを探る手掛かりとするために、通常の開始コドンを抜いたPlasmidを構築し、±開始コドンで合成量を比較したところ、+開始コドンと比較して、-開始コドンでは、ポリグルタミンの合成量は低下し合成産物の分子量がわずかに小さくなった。ポリセリンの場合は分子量に変化はなかったが、凝集性が増した。また、ポリアラニンの場合は分子量にも凝集性にも変化がなかった。以上より、ポリグルタミンのほとんどは既存の位置の開始コドンに依存した翻訳により合成が行われているが、ポリセリンやポリアラニンは先行研究の通り、既存の開始コドンよりも下流からのRAN翻訳により合成されていることが我々の合成系でも再現できた。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

研究の進捗に関しては、疾患に関連する細胞内現象の一部を、我々が構築した無細胞タンパク質合成系(試験管内タンパク質合成系)で再現することに成功しており、細胞内反応をin vitroで迅速に再現・解析するためのシステム構築を行えている。また、本研究のベースとなる再構成型タンパク質合成系の維持に必要な構成因子群の供給(翻訳関連因子群の調製)に関しても、前年度に引き続き、個々の因子の発現方法や精製方法における問題点について、研究室に配属される学部生や大学院生と協力しながら、ファインチューニングを進めて、より良い研究ツールへの発展を試みている。

今後の研究の推進方策

発現Plasmidの開始コドンを終始コドンへ変更、特定の配列の前後に終始コドンを導入、またはそれらを組み合わせることで、予め遺伝子上で翻訳を制御しておいて、その制御に翻訳産物が合致するかを、無細胞タンパク質合成系を利用して解析する。これによりCAGリピートのrepeat-associated non-ATG 翻訳(RAN翻訳)の機構の解明を目指す。

  • 研究成果

    (6件)

すべて 2019

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (5件) (うち招待講演 2件)

  • [雑誌論文] HCV IRES Captures an Actively Translating 80S Ribosome.2019

    • 著者名/発表者名
      Yokoyama T, Machida K, Iwasaki W, Shigeta T, Nishimoto M, Takahashi M, Sakamoto A, Yonemochi M, Harada Y, Shigematsu H, Shirouzu M, Tadakuma H, Imataka H, Ito T.
    • 雑誌名

      Molecular Cell

      巻: 74 ページ: 1205-1214

    • DOI

      10.1016/j.molcel.2019.04.022.

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] アクチン生合成の試験管内再現2019

    • 著者名/発表者名
      町田幸大、神澤空流、白子太紀、井寄真仁、今高寛晃
    • 学会等名
      第19回 日本蛋白質科学会年会・第71回日本細胞生物学会大会 合同年次大
  • [学会発表] 試験管内アクチン生合成2019

    • 著者名/発表者名
      町田 幸大, 神澤 空流, 白子 太紀, 宮脇 翔馬, 今高 寛晃
    • 学会等名
      大阪大学蛋白質研究所セミナー:化学によるタンパク質修飾の機能解析を目指して
    • 招待講演
  • [学会発表] 再構成型タンパク質合成・フォールディング共役システムを利用したin vitroアクチン生合成2019

    • 著者名/発表者名
      町田幸大、白子太紀、井寄真仁、今高寛晃
    • 学会等名
      第92回 日本生化学会年会
    • 招待講演
  • [学会発表] 再構成型タンパク質合成・フォールディング共役システムを利用した in vitroアクチン生合成2019

    • 著者名/発表者名
      町田 幸大, 宮脇 翔馬, 白子 太紀, 今高 寛晃
    • 学会等名
      第14回 無細胞生命科学研究会
  • [学会発表] アクチン遺伝病の試験管内解析2019

    • 著者名/発表者名
      町田幸大、神澤空流、白子太紀、今高寛晃
    • 学会等名
      第42回 日本分子生物学会

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公開日: 2021-01-27  

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