| 研究課題/領域番号 |
17H05029
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
吉永 直子 京都大学, 農学研究科, 助教 (40456819)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| キーワード | FACs / イリドイド / gardenoside / β-alanine |
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| 研究実績の概要 |
鱗翅目昆虫におけるFACs生合成酵素の同定に成功した。ハスモンヨトウ週齢幼虫を解剖し、得られた粗酵素液のミクロソーム画分よりFACs生合成能を指標に活性酵素を精製した。LCMSMS及びMALDI-TOF-MS分析とデータベースサーチの結果、鱗翅目特異的なエステラーゼファミリーの一種であることが示唆された。
この候補遺伝子の大腸菌や昆虫細胞-バキュロウィルス発現系を用いた異種発現では、どちらもFACs生合成能は検出できなかったが、ハスモンヨトウ幼虫虫体を使ったRNAiで該当する酵素をノックダウンしたところ、腸管内のFACs量が減少した。ゲノム編集によるノックアウトに進むにあたって極めて重要な成果である。
クチナシイリドイドの解毒について、gardenosideとグルコースを同時に摂食させた場合に、クチナシ生葉を食べた時と同程度のβ-alanineが腸管内で誘導されることを確認した。このような共力活性は他のマンノース等の糖では見られなかったことから、配当体の糖が遊離している点が重要であると示唆された。配糖体型の植物毒に対する昆虫側の解毒応答に遊離した糖が関わっていた例はほとんど知られていない。また、クチナシ葉抽出物中の有機層にはハスモンヨトウのβ-alanine誘導活性を抑制する活性成分が含まれることを明らかにした。これらの成果について、応用動物昆虫学会2019年度大会の公開シンポジウムで招待講演を行ったところ非常に高い評価を得た。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題で最も難関だったFACs生合成酵素の同定に成功した。この進捗に問題があれば、予定を変更して餌を用いたFACｓの擬似的ノックダウンに進むことも考えていたが、計画変更せずにゲノム編集に進むことができる。
また、ハスモンヨトウの解毒戦略について、糖の関与があることは昨年度の成果で報告したが、糖の主成分であるマンノースではなく、グルコースだけがβ-alanine誘導活性に関与していたことが明らかになった。どうやって認識しているかは今後の課題となるが、何故それを認識するかについては、「配糖体からアグリコンが遊離している」状況を検出するためと考えれば説明できる。
本研究課題の前半を締めくくるのに十分な結果が揃ったと考える。
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| 今後の研究の推進方策 |
FACｓ生合成酵素に関しては、今回確率した昆虫細胞を使ったアッセイ系でSiRNAに挑戦するとともに、ゲノム編集を試みる。ハスモンヨトウを用いたTALENは予備試験的にほぼ手法が確立できており、crispr/cas9系を用いたゲノム編集も共同研究者の尽力により確立されつつある。FACsノックアウト系統のハスモンヨトウを作出し、通常のハスモンヨトウと比べて窒素代謝にどのような影響が出ているか、また解毒能力にも何らかの影響があるかを明らかにしていく。
また、β-alanine生合成阻害剤や生合成酵素のノックダウンを行い、ハスモンヨトウにおけるクチナシ毒の解毒応答への影響を評価する。さらに、人工飼料の窒素養分含量を段階的に調節したものにgardenosideを添加して摂食させることで、餌中の栄養条件と解毒メカニズムの量的関係を明らかにする。
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