| 研究課題/領域番号 |
17H05047
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
木内 隆史 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (60622892)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | カイコ / 休眠 / ゲノム編集 / トランスクリプトーム / ChIP-seq |
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| 研究実績の概要 |
胚休眠制御カスケードの全容を解明するために、下記の5つの課題に取り組んだ。
1. 私たちが同定したZ染色体上に座乗する休眠制御遺伝子Lmは転写因子をコードしていた。本研究ではLm制御下にある遺伝子を同定するためにChIP-seqを行う予定だが、そのためにはLm遺伝子の上流あるいは下流にFLAGタグを導入したノックインカイコを作出する必要がある。2018年度に、CRISPR/Cas9システムを用いてノックインを試みたが、ノックインカイコを得ることができなかった。
2. 同様に、Lm遺伝子の下流にEGFP遺伝子を導入したノックインカイコを作出しようとしたができなかった。
3. 新規休眠制御遺伝子Lm-2を同定するために、ポジショナルクローニングを行う予定であった。しかし、飼育条件を再検討したが、BC1において休眠性がうまく分離する条件を決めることができなかった。
4. pndおよびpnd-2遺伝子は、休眠ホルモンに曝された卵から発生する胚子が休眠に入るときに機能する遺伝子である。産卵後から数日間、正常カイコと各ノックアウトカイコの比較トランスクリプトーム解析を行った結果、各遺伝子に制御される遺伝子群を俯瞰することができた。
5. ヤママユガ科であるシンジュサンの蛹休眠を制御する遺伝子を同定するために、非休眠性のエリサンを繰り返し戻し交雑することで作出した休眠エリサン系統のゲノム配列を解析した。その結果、休眠性に必要な遺伝子領域を絞り込むことに成功し、制御遺伝子の候補を得ることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
変異導入効率を改善させた条件でCRIS-PICh法を試みたが、ノックインカイコを得ることができなかった。2019年度中にChIP-seqやRNA-seqを試みるために、早急にノックインカイコを得る必要がある。
新規休眠制御遺伝子Lm-2を同定するために、ポジショナルクローニングを行う予定であった。しかし、飼育条件を再検討したが、BC1において休眠性がうまく分離する条件を決めることができなかった。研究の方向性に転換を要する。
しかし一方で、pndおよびpnd-2遺伝子のノックアウトカイコに関しては計画通りトランスクリプトーム解析を実施し、制御下にある遺伝子を俯瞰することができた。
さらに、当初困難が予想されたヤママユガ科であるシンジュサンの蛹休眠を制御する遺伝子の同定に関しては、非休眠性のエリサンを繰り返し戻し交雑することで作出した休眠エリサン系統のゲノム配列を解析することで、休眠性に必要な遺伝子領域を絞り込むことに成功し、制御遺伝子の候補を得ることができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
胚休眠制御カスケードの全容を解明するために、下記の5つの課題に取り組む。
1. Lm制御下にある遺伝子をCETCh-seqで同定するために、CRIS-PITCh法を用いてLm遺伝子の上流あるいは下流にFLAGタグを導入したノックイン（KI）カイコを作出する。2019年度も条件検討を進めつつ、カイコにおいて実績があるTAL-PICh法を用いることも考慮してKIを成功させる。さらに、組織を用いてFLAG抗体を用いたCETCh-seqを行い、Lm制御下にある遺伝子を同定する。
2. 同様に、CRIS-PITCh法あるいはTAL-PICh法を用いてLm遺伝子の下流にEGFP遺伝子を導入したKIカイコを作出する。また、対照としてLm遺伝子をEGFP遺伝子に置換することで機能破壊したカイコを作出する。Lmに制御される遺伝子を抽出する目的で、正常カイコとLmノックアウト（KO）カイコのLm発現部位におけるトランスクリプトームの比較を行うため、脳からGFP陽性細胞を分取し、RNA-seqを行う。
3. 新規休眠制御遺伝子Lm-2を同定するために、ポジショナルクローニングを行う予定であった。しかし、飼育条件を検討したが、BC1において休眠性がうまく分離する条件を決めることができなかった。2019年度は方向性を改め、Lmと同じシステムに関与するいくつかの遺伝子についてKOカイコを作出し、休眠性に影響するか否かを調べることにする。
4. pndおよびpnd-2遺伝子KOカイコの比較トランスクリプトーム解析を行った結果、各遺伝子に制御される遺伝子群を俯瞰できた。今年度は、これら遺伝子群の休眠への関与を候補遺伝子のKOにより調査する。
5. ヤママユガ科であるシンジュサンの蛹休眠を制御する遺伝子を同定するために、休眠エリサン系統のゲノム解析により明らかになった休眠制御遺伝子の候補をKOし、休眠性への関与を証明する。
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