| 研究課題/領域番号 |
17H05106
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
北條 宏徳 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 助教 (80788422)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| キーワード | 骨発生 / 転写制御 / Runx2 / エピゲノム |
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| 研究実績の概要 |
はじめに骨芽細胞・軟骨細胞におけるRunx2ゲノム結合部位の同定を行った。In vivo骨芽細胞・軟骨細胞におけるRunx2 ChIP-seq解析において、特異的抗体を用いた免疫沈降の効率を最大限高めるため、Runx2遺伝子座にタグ（Biotinと3xFlagの融合ペプチドをコードする遺伝子）をノックインしたマウスを用いた。マウス新生仔頭蓋骨および肋軟骨からそれぞれ骨芽細胞・軟骨細胞を単離し、抗FLAG抗体を用いたChIP-seq解析を行った。申請者らが最適化した、バイオインフォマティクスの解析ライン（Bowtie－SAMtools－BEDtools－Cisgenomeを利用）により、Runx2ゲノム結合領域をピークとして検出した。
次に、Runx2が発現・機能する、骨芽細胞と肥大軟骨細胞における、細胞種特異的なエピゲノム・トランスクリプトームプロファイルを取得した。骨芽細胞と肥大軟骨細胞に加えて、比較対象として肥大分化前の軟骨細胞の情報も得た。各種レポーターマウスを使用しマウス新生仔頭蓋骨および肋軟骨から細胞を回収後、蛍光蛋白質を指標にFACSによりレポーター陽性細胞を単離した。単離した細胞を用いて、ATAC-seq（an assay for transposase-accessible chromatin using sequencing; Buenrostro JD et al., Nat Methods 2013）を行った。トランスクリプトーム解析に関しても同様の手法で細胞を単離後RNA-seqを行った。以上より、骨芽細胞・軟骨細胞におけるRunx2-DNA結合プロファイル、エピゲノムプロファイルおよびトランスクリプトームプロファイルが得られた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当初予定していた実験は全て完了し、解析に必要なデータを取得できた。
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| 今後の研究の推進方策 |
細胞種特異的・機能的Runx2標的遺伝子の探索・検証実験を行う。これまでに取得した骨芽細胞・軟骨細胞におけるRunx2ゲノム結合部位情報、エピゲノム・遺伝子発現プロファイルに加えて、クロマチン三次元構造TADを統合して、機能的Runx2標的遺伝子を探索する。解析により得られた候補の骨芽細胞、軟骨細胞への分化の寄与をin vitroレポータアッセイおよび機能喪失実験で検証する。
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