| 研究実績の概要 |
本年度は、まずこれまでに得られた骨格組織におけるRunx2の機能的エンハンサー候補に対して、in vivoエンハンサー活性を検証した。候補エンハンサー配列とlacZ::GFPレポータ遺伝子を有する合成遺伝子を発現するレポータートランスジェニックマウスを作出し、胎生16日齢マウスにおけるwhole mount x-gal染色を行った。その結果、骨格組織特異的なエンハンサー活性が確認された。次に、本レポータマウスの頭蓋骨および脛骨を用いた免疫組織学的解析を行った。その結果、検討したいずれの組織においても、エンハンサー活性が認められ、エンハンサー活性を有する細胞は、Runx2およびOsterix陽性であった。さらに、本エンハンサー領域の骨芽細胞分化に対する影響を検討するため、Cas9恒常的発現骨芽細胞株に、候補エンハンサー領域の両端を標的とするガイドRNAをレンチウイルスシステムで導入した。クローニングおよびジェノタイピングによりエンハンサー欠損骨芽細胞株を作製した。本細胞を用いた骨芽細胞分化誘導培地による骨芽細胞分化実験の結果、本欠損細胞は骨芽細胞分化の指標であるALP染色の染色性の低下と骨芽細胞分化マーカーの遺伝子発現の減少が確認された。以上より、本解析を通して、Runx2-DNA結合プロファイル、エピゲノム・トランスクリプトームプロファイルおよび三次元クロマチン構造の統合解析とin vitro, in vivo検証実験により、骨格発生におけるRunx2を介した転写制御ネットワークの一端が明らかになった。
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