| 研究課題/領域番号 |
17H06096
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
深田 吉孝 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 教授 (80165258)
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| 研究分担者 |
饗場 篤 東京大学, 大学院医学系研究科(医学部), 教授 (20271116)
高尾 敏文 大阪大学, 蛋白質研究所, 教授 (10197048)
小島 大輔 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 講師 (60376530)
清水 貴美子 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (50451828)
吉種 光 東京大学, 大学院理学系研究科(理学部), 助教 (70569920)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-25 – 2022-03-31
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| キーワード | サーカディアンリズム / 転写後・翻訳後修飾 / 位相制御 / 高次脳機能 / 老化 / 概日振動機構 / レドックス変動 |
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| 研究実績の概要 |
マウス行動リズムの光同調を担う網膜神経節細胞ipRGCにおいて、光受容体メラノプシンOPN4がGs-cAMP経路を光活性化するか否かを検証するため、cAMPを検出する発光レポーターをipRGC特異的に発現するマウスの作製を試みている。Transgenicマウス系統の樹立を目指したが、現状では目的の変異系統は得られていない。そこで、Opn4遺伝子座に組換え酵素 Cre をノックインしたマウス系統とアデノ随伴ウイルスを組み合わせる実験系を構築した。また、光以外の位相制御系として、新しい時計入力の鍵分子としてASKキナーゼを同定した。培養細胞のリズム可視化実験において、慢性的な細胞ストレスは細胞リズムの周期を変化させ、一過的な細胞ストレスはその位相を大きく変化させたが、これらの効果はASKキナーゼの欠損によって完全に消失した。さらに、マウス個体においては、光による行動リズムの周期変化と位相シフトにASKキナーゼが関与することを示した。これらの成果は国際雑誌（Imamura et al., PNAS, 2018）に報告した。時計タンパク質の修飾状態の組み合わせで時が刻まれるという「クロノコード」という概念の理解に向け、時計タンパク質PER2をリン酸化するキナーゼSIK3を同定し、国際雑誌（Hayasaka et al., Elife, 2017）に報告した。また、最先端質量分析装置を新たに導入して生化学的な解析をスタートし、細胞ストレスに応答してASK依存的に時計タンパク質CLOCKのT843とS845がリン酸化されることを見出した。体内時計の出力系として、長期記憶能の概日リズム制御に取り組んでいる。この制御に重要だと考えられる SCOPとK-Rasのラフトにおける相互作用リズムを観察するために、FRETによる可視化を目指している。様々な蛍光蛋白質の組み合わせの結果、mCherry-SCOPまたはShadowY-SCOPとEGFP-KRasの組み合わせで、最も効率良く神経細胞に発現させることができた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究課題においては、当研究室のある本学理学部３号館の学内オープンラボスペースに動物実験室をセットアップする予定であったが、学内措置の決定に長い時間を要した。そこで、動物飼育装置の導入を次年度に繰り越したが、順調に動物実験を遂行することができた。その一方で、細胞レベルの実験や生化学的な解析において当初の予想を超える研究成果を挙げた。その結果、ASKキナーゼやSIK3キナーゼの概日時計における重要性を世界に先駆けて論文公表することができた。
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| 今後の研究の推進方策 |
ipRGCにおいてOPN4がGs-cAMP経路を光活性化するか否かを検証するため、これまでに、アデノ随伴ウイルスを用いた一過的な導入法とOpn4-Cre系統を組み合わせることにより、ipRGC特異的に外来遺伝子を発現誘導する系を構築した。そこで今後は、この方法を用いてipRGC特異的にGloSensor-cAMPを発現するマウスを作製し、その網膜のex vivo光刺激実験により上記仮説を検証する。時計振動を担う転写制御については、ゲノム中の時計コアBoxと時計出力Boxを探索するとともに、時計タンパク質の修飾状態の組み合わせで時が刻まれるという新しい概念「クロノコード」の理解を目指す。初年度に導入した質量分析装置を駆使して、網羅的なプロテオーム解析を展開すると共に、リン酸化やユビキチン化などの翻訳後修飾の決定に向けて、修飾ペプチドの単離条件を探る。さらに、同定された分子や翻訳後修飾の機能を細胞・個体レベルで解析する。必要に応じて遺伝子改変マウスの作製を開始する。蛍光蛋白質で標識したSCOPとK-Rasを用いて神経細胞内での相互作用を観察するため、実験条件の最適化を進め、記憶形成の概日リズム制御の実体を可視化を目指す。また、時計出力として、ニューロステロイド7α-OH-Pregnenoloneが老化による空間記憶低下に関わると考えているが、この合成酵素であるCyp7b1の欠損マウスを用いて、海馬依存性の記憶機能あるいは情動などの高次脳機能への影響を調べる計画である。
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