| 研究課題/領域番号 |
17H06097
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
嶋田 一夫 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 教授 (70196476)
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| 研究分担者 |
上田 卓見 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 助教 (20451859)
竹内 恒 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究チーム長 (20581284)
西田 紀貴 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 准教授 (50456183)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-25 – 2022-03-31
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| キーワード | 核磁気共鳴法 / 膜タンパク質 / 動的構造平衡 |
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| 研究実績の概要 |
GPCRのシグナル選択機構の解明については、(1)昆虫細胞発現系において、GPCRのアミノ酸の2H標識率を変化させて近接するアミノ酸の種類を同定する方法、およびIle、Leu, Val, Thr残基を選択的に標識する手法を確立した。(2) 構造平衡のパラメータをマルコフ連鎖モンテカルロ法により網羅的に探索して、最適値と誤差をベイズ推定する手法を開発し、走温性制御分子である CheA-CheY 複合体における、構造平衡の平衡定数を解明した。(3) β2ARのC末端領域を区分選択標識してリン酸化反応前後の β2AR-rHDLのC末端領域のNMRシグナルを観測することに成功した。また、リン酸化に伴い、膜貫通領域がアレスチン複合体に近い状態に構造変化することが明らかとなった。
イオンチャネルにおける電流制御機構の解明については、GIRKからの分子内PRE効果を用いて、Gαβγ3量体中のGαとの原子間距離情報を収集し、複合体構造モデルを構築することに成功した。また、GIRK開口因子であるエタノールによって細胞内ゲートの構造平衡が遷移する機構を明らかにした。KcsAについては、脂質組成の異なるナノディスクに再構成する調製法を確立し、細胞内側のゲートの構造平衡が脂質組成依存的に変化することを示した。
動的立体構造解析による多剤耐性システムの機能メカニズムの解明については、H29年度は、複数の多剤耐性転写因子（LmrR, QacR, BmrR）の動的転写制御機構を解析し、すべての多剤耐性転写因子が、薬剤の有無にかかわらず、数十μM程度の非特異的DNA吸着を示すこと、薬剤存在下では、特異的DNAに結合した場合とは逆方向に構造平衡が移行し、結合定数が数倍低下することを見出した。また、多剤耐性トランスポーターについては、LmrCDの他、４種（QacA, Bmr, NorM, pfMATE）について発現、精製、安定同位体標識を行い、pfMATEが良好なNMRシグナルを与えることを見出した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
GPCRのシグナル選択性については、当初予定していた安定同位体標識法の確立 (Kofuku et al., J. Biomol. NMR, in press)、マルコフ連鎖モンテカルロ法を用いたベイズ推定によrる動的構造解析法の確立(Minato et al., Sci. Rep. (2018)) についていずれも達成することができた。また、当初計画通りGPCRのC末端領域を区分標識して、リン酸化やアレスチンとの複合体に伴うGPCRの構造変化の解析する系を構築した。それにより、C末端領域のT360を含む部位が膜貫通領域と相互作用することや、リン酸化に伴い膜貫通領域がアレスチン複合体に近い状態に構造変化するという新しい知見を得ることにも成功した (Shiraishi et al., Nat. Commun. (2018))。
イオンチャネルの電流制御機構については、当初予定していたGIRK細胞内領域のみでなく、より難易度の高い全長GIRKを研究対象とし、さらにそれをナノディスク中に再構成し解析することで、Gαβγの脂質膜との相互作用も含めた剛体ドッキングモデルを作成することに成功した。また、GIRKに関する発展的研究として、エタノールによってGIRKが開構造になる機構を構造平衡の観点より明らかにした (Toyama et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (2018))。KcsAについても、脂質組成の異なるナノディスクに再構成する調製法を確立に成功し、細胞内側のゲートの構造平衡が脂質組成依存的に変化することを見出した。
多剤耐性システムの機能メカニズム解明については、多剤耐性システムを構成する複数の転写因子について動的転写制御機構を解明するとともに 、良好なNMRスペクトルを与えるトランスポーターを見出すこともできた。
以上より、本計画は想定以上に進んでいると判断している。
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| 今後の研究の推進方策 |
バイアスリガンドによるGPCRのシグナル選択機構の解明については、β2アドレナリン受容体(β2AR)について、昨年度開発した安定同位体標識手法を応用して、膜貫通領域の構造情報の数を増大させる。また、δオピオイド受容体について、各種リガンド結合状態のNMRシグナルを観測し、動的構造情報を得る。さらに、β2ARとGタンパク質複合体における β2ARおよびGタンパク質(アナログ)のNMRスペクトルを取得する。また、リン酸化β2AR-アレスチン複合体における、アレスチンのNMRスペクトルを取得する。得られたスペクトルに基づいて、Gタンパク質およびアレスチンの活性化に特徴的な動的構造を同定する。加えてGPCR下流のシグナル伝達蛋白質の細胞内NMR観測に着手する。
イオンチャネルにおける電流制御機構の解明については、GIRKとGαβγとの剛体ドッキングにより得られた複合体構造モデルを検証するために、結合の選択性を担うことが想定されるGαサブユニットの変異体やドメインのキメラ体を調製し、結合親和性やGIRK活性化能を比較する。脂質二重膜と直接コンタクトするKcsA膜貫通領域に着目し、疎水性アミノ酸同士の相互作用を変調した変異体を設計する。KcsA変異体の単一チャネル電流の解析からイオン透過活性を評価し、NMRによる動的構造解析の結果と比較することで、脂質環境下でイオン透過活性が変化する詳細な分子機構を考察する。
多剤耐性システムの機能メカニズムの解明については、昨年度までに良好なNMRスペクトルを与えることが示されたpfMATEについて、その輸送活性がpH依存性を有することに着目し、pH変化と相関する構造平衡変化を捕捉し、輸送活性に直結する動的構造変化を抽出・解析する。また同時に、薬剤結合ともなう構造平衡変化について解析する。またpfMATEは協同する多剤耐性転写因子が同定されていないことから、遺伝子解析などによりこれを同定する。
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