| 研究課題/領域番号 |
17H06097
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
嶋田 一夫 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 教授 (70196476)
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| 研究分担者 |
上田 卓見 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 准教授 (20451859)
竹内 恒 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究チーム長 (20581284)
西田 紀貴 千葉大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 教授 (50456183)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-25 – 2022-03-31
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| キーワード | 核磁気共鳴法 / 膜タンパク質 / 動的構造 |
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| 研究実績の概要 |
GPCRのシグナル選択性の解明：β2アドレナリン受容体(β2AR)について、Leu残基主鎖アミド基のNMRシグナルの帰属を完了した。δオピオイド受容体について、分子内側を向いたMet残基のNMRシグナルを帰属した。また、μオピオイド受容体のシグナル伝達活性が、アロステリックリガンドにより正に制御されることを観測した。三量体G蛋白質と複合体を形成したβ2ARのMet残基のNMRシグナルを観測した。加えて、β2AR結合状態におけるアレスチンのIle残基のNMRシグナルを観測した。さらに、Gタンパク質を介した細胞内シグナル伝達機構解明の一助として、低分子量Gタンパク質の一種であるRac1について発癌性変異体（P29S）の恒常的な活性化機構の解明にも成功した。
イオンチャネルにおける電流制御機構の解明：内向き整流性イオンチャネルGIRKとGαβγとの複合体構造計算を行い、Gαi3βγの脂質修飾部位が膜と近接する生理的な複合体構造を得た。得られた複合体モデルを検証するために、BRET法を用いアッセイ系の構築を行った。HEK293T細胞にGPCR, Gα, 蛍光タンパク質融合Gβγ, ルシフェラーゼ融合GIRKを発現させた。GPCR活性化に伴うGβγ-GIRKの結合をBRETの変化から検出することに成功した。
多剤耐性システムの機能解明：昨年度、良好なNMRスペクトルを与えることを見出した高度好熱菌由来のpfMATEについて、その輸送活性がpH依存性を有することに着目し、pH変化と相関する構造平衡変化を捕捉した。その結果、輸送活性に直結すると思われる大規模な動的構造変化を抽出することに成功した。また同時に、薬剤結合ともなう構造平衡変化について解析し、薬剤結合自体は大きな構造変化を誘起しないことを見出した。またゲノム解析により、pfMATEと協同する多剤耐性転写因子と思われる配列を同定した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
GPCRのシグナル選択性の解明：当初予定していた、β2ARの膜貫通領域の構造情報の数の増大、δオピオイド受容体の各種リガンド結合状態におけるNMR シグナルの観測、β2AR結合状態のアレスチンのNMRシグナルの観測について、いずれも達成することができた。また、当初計画通り、β2ARとG タンパク質の複合体のNMRスペクトルを取得した。GPCRの構造と創薬に関する総説をKurt Wuthrich 博士と共同で執筆し(Nat Rev Drug Discov 2019)、生細胞中のGPCR-リガンド複合体を蛍光標識して細胞内局在の変化を観測する手法の開発や(Chem 2018)、Rac1の発癌性変異体の動的構造解析に基づく活性化機構の解明にも成功するなど(Sci Adv 2019)、当初予定を上回る成果が出ている。
イオンチャネルにおける電流制御機構の解明：ナノディスクに再構成したGIRKとGαβγとの間のPRE情報に基づいて複合体構造を計算し、生理的な膜環境においても妥当と考えられるドッキングモデルを得ることができた。さらに、細胞内で複合体モデルを検証するためのBRET実験系の構築も完了したことから、GIRK開口のファミリー選択性の決定に向けて順調に研究が進行している。
多剤耐性システムの機能解明：高度好熱菌由来のpfMATEについてはこれまで輸送された薬剤が、離脱する過程は明らかになっていたものの、輸送活性に直結した開口方向が変わるような大規模な動的構造変化は抽出できていなかった。今回、NMRにより、このような構造変化を捉えられたことで、動的構造解析により輸送機構が明らかになる期待が高まった。またゲノム解析により、pfMATEと協同する多剤耐性転写因子と思われる配列を初めて同定した。よって、多剤耐性システムの機能解明に向けた研究は順調に進行している。
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| 今後の研究の推進方策 |
GPCRのシグナル選択性の解明：β2ARについて、昨年度までに帰属完了した残基のNMRシグナルを利用して、活性型構造における原子間距離の情報を取得する。さらに、構造平衡のパラメータをマルコフ連鎖モンテカルロ法により網羅的に探索して、観測したNMRシグナルと合致する β2ARの構造平衡モデルを構築する。また、オピオイド受容体について、G タンパク質もしくはそのアナログが結合した状態におけるNMRスペクトルを取得する。さらに、GPCRキナーゼと β2ARが結合した状態における、GPCRキナーゼおよび β2ARのNMRスペクトルを取得する。得られたスペクトルに基づいて、GPCRの構造平衡において、GPCRのどの部位の構造がどのように変動することで活性が規定されるかを明らかにする。
イオンチャネルにおける電流制御機構の解明：これまでに確立した細胞内でのGIRK活性化能を検出するBRET実験系を用いて、Gαi3の配列の一部をGIRKと共役しないGαqに置換したキメラタンパク質多数作製し、GIRK開口のファミリー選択性を決定する部位を同定する。また、より高分子量の膜タンパク質の動的構造を解析するため、13C間接観測軸の周波数選択励起を利用した新たなNMR手法の開発し、みかけの分子量が200kDaを超えるKirBac1.1へ適用する。
多剤耐性システムの機能解明：変異実験とNMRを用いた動的構造解析により、pH依存的な動的構造変化を誘起する責任残基を明らかにし、pfMATEの基質輸送モデルを確立する。またpfMATEと協同する多剤耐性転写因子と思われる配列をゲノム上に同定したことから、これについて発現系を構築し、立体構造解析に着手する。加えて、病原性細菌由来の多剤耐性転写因子についても、その転写調節機構を明らかにし、病原体における多剤耐性システムの機能メカニズムについて理解を深める。
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