| 研究課題/領域番号 |
17H06097
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| 研究機関 | 国立研究開発法人理化学研究所 |
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研究代表者 |
嶋田 一夫 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, チームリーダー (70196476)
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| 研究分担者 |
上田 卓見 東京大学, 大学院薬学系研究科(薬学部), 准教授 (20451859)
竹内 恒 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究グループ長 (20581284)
西田 紀貴 千葉大学, 大学院薬学研究院, 教授 (50456183)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-25 – 2022-03-31
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| キーワード | 核磁気共鳴法 / 膜タンパク質 / 動的構造 |
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| 研究実績の概要 |
GPCRのシグナル選択性の解明：μオピオイド受容体において、TM6ヘリックスの細胞内側が活性の高い構造、活性の低い構造、活性の無い構造の平衡状態にあり、アロステリックリガンドは活性の高い構造に平衡を偏らせることでシグナル伝達活性を正に制御することを明らかにした。β2アドレナリン受容体のNMR解析により、アレスチンバイアスリガンド結合状態では、TM3およぶTM5の細胞内側に構造変化が生じることを明らかにした。さらに、プロテインキナーゼAによるリン酸化に伴い、TM領域が構造変化することを見出した。CXCR4のNMR観測を行い、遮断薬およびSDF-1存在下において活性化に伴う広範な構造変化を見出すことに成功した。
イオンチャネルにおける電流制御機構の解明：KcsA K+チャネルにおいて、細胞内側に位置する細胞内ゲートの動的構造が変化し、細胞内側のK+が細胞外へ透過できない閉じた構造に構造平衡が遷移することで、K+透過活性が低下することを明らかにした。また変異体解析から、構造平衡の制御にはTMヘリックス同士の接触部位が重要であることが明らかとなった。さらに、チャネル電流解析から構造平衡による細胞内ゲートの開閉の遷移とK+透過状態-非透過状態の活性変化のタイムスケールが対応していることを証明した。
多剤耐性システムの機能解明：高度好熱菌由来のpfMATEについて、強制的に内向き開口状態を作る変異体などとの構造比較を行うことで、平衡下にある各構造の特徴づけをおこなうことに成功した。また、pfMATEと協同する多剤耐性転写因子と思われるタンパク質（TrMate）について、その立体構造を決定し、その構造中に疎水的なポケットが存在することを確認することが出来た。さらに、TrMateはpfMATEのオペレーター領域のDNA配列と特異的に結合することが示され、転写抑制因子として働くことが示唆できた。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
GPCRのシグナル選択性の解明：当初計画通り、バイアスリガンド結合状態の β2アドレナリン受容体、アロステリックモジュレーター結合状態の μオピオイド受容体、CXCR4結合状態のSDF-1に特徴的な構造を同定することに成功して、GPCR間で保存された構造変化様式に加えて、多様な様式でGPCRのシグナル伝達活性が制御されることを明らかにした。さらに、当初予定になかった、プロテインキナーゼAによるリン酸化に伴うシグナル伝達活性および構造の変化を観測することにも成功した。
イオンチャネルにおける電流制御機構の解明：当初計画通り、KcsAチャネルの電流制御機構についてNMR法を用いた動的構造解析ならびにパッチクランプ法を用いた電流解析から明らかにすることに成功した。GIRKのGタンパク質サブタイプ選択的な活性化機構と併せて当初の計画はほぼ達成されたものと判断している。
多剤耐性システムの機能解明：当初計画通り、輸送活性に直結するpH依存的に動的構造変化を誘起する責任残基を同定し、プロトン対抗輸送による基質輸送モデルを確立することができた。またpfMATEと協同と思われる多剤耐性転写因子について、立体構造解析に着手した。さらに、病原性細菌由来の多剤耐性転写因子についても、その転写調節機構を明らかにし、論文発表につなげるなど、想定以上の成果も上がっている。
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| 今後の研究の推進方策 |
GPCRのシグナル選択性の解明：オピオイド受容体の様々な部位に導入したメチオニン残基のNMRシグナルをアロステリックモジュレーター存在下で観測することで結合部位を同定するとともに、リガンドの種類や活性に影響する変異の導入、アロステリックモジュレーターの有無の組み合わせを様々に変えたオピオイド受容体のシグナル伝達活性の測定およびNMR解析を行う。加えて、モノマー・ダイマー平衡を偏らせることで活性を変調することが知られている変異を導入したSDF-1が結合した状態におけるCXCR4の動的構造をNMR解析する。以上のように、様々な要因により活性が変調した状態におけるシグナル伝達活性と動的構造平衡の関係を調べることで、GPCRのシグナル伝達活性を調節する機構を、立体構造に基づいて包括的に解明する。
多剤耐性システムの機能解明：前年度までに明らかにした基質輸送モデルに基づいて考えると、pfMATEは内向き開口状態のときには基質に対する結合が強くなると想定される。そこで、主に外向き開口状態で存在するWTと、内向き開口状態を作る変異体に対する基質の結合強度を定量し、その検証を行う。pfMATEが内向き開口状態に強く結合するのであれば、基質のアフィニティの違いと、水素原子との結合による構造転換により、リガンドを排出するモデルが確立する。またpfMATEと協同する多剤耐性転写因子と目されるTrMateについて、強く結合するリガンドの探索を行うとともに、TrMateに結合することが判明したリガンドが、pfMATEに対しても同程度の親和性で結合するかを検証する。このことにより、多剤耐性システムが一定濃度の薬剤により制御され、薬剤を排出可能か検証する。その際、前年度に決定したTrMateの結合領域を持つ転写アッセイ系を構築し、TrMateが転写抑制因子として働くことを証明する。
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