極めて柔らかい膜環境にあるタンパク質分子のナノ動態イメージングの実現

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H06121
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 安藤 敏夫 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 特任教授 (50184320)
• 研究期間 (年度): 2017-05-31 – 2022-03-31
• キーワード: 膜タンパク質 / 高速AFM / 走査型イオン伝導顕微鏡 / ダイナミクス / バイオイメージング

研究実績の概要

代表者は様々な技術開発を通して従来のAFMよりも千倍速い高速原子間力顕微鏡（高速AFM）を実現し、個々のタンパク質分子機械の機能動態をリアルタイム、高解像で直接観察することに世界で初めて成功した。これまでに着実に進められてきた高速AFMのバイオ応用研究は、高速AFMが他の手法では得られない発見を可能にするブレークスルー技術であることを実証してきた。その一方で、現在の最先端高速AFMでも観察できない系があることも明らかになってきた。具体的には、生きた真核細胞や細胞内小器官の膜にあるタンパク質の高解像観察ができない。その理由は、膜は非常に柔らかく、AFM探針との接触により大きく歪むためである。また、精製膜タンパク質系においても、膜表裏の間に生理的には存在するイオン環境を持たせることができず、生理的環境下での膜タンパク質を観察することができない。そこで、本プロジェクトで以下①②の技術を実現し、これら困難な観察が可能であることを実証する。
①これまで進めてきた非接触イメージング可能な走査型イオン伝導顕微鏡（SICM）の高速化・低ノイズ化を更に進展させるとともに、カーボンナノチューブ（CNT）などを利用し解像度を向上させ、非侵襲、高解像、高速なSICMを実現する。
②膜タンパク質を含む脂質平面膜の小さな面を宙に張り、膜表裏の間に生理的イオン環境を形成できるアッセイ系を開発する。
本プロジェクト初年度にあたる2017年度では、上記研究実施に必要な環境を整えるとともに、「現在までの進捗状況」に記したとおり、①についてはCNT利用技術を開拓してCNTを流れるイオン流の計測に成功し、②については必要なアッセイ系の基礎となるタンパク質の二次元結晶作成に成功し、次年度以降の順調な進展に繋がる良好な成果を得ることができた。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

SICMの解像度向上については、CNTの超音波による切断、短いCNTの可溶化、ガラスナノピペット先端の脂質二重層膜によるギガシール形成、その脂質二重層膜へのCNTの挿入、CNT内部を流れるイオン流の計測まで成功させた。CNTの膜への挿入は脂質の流動性などの性質、ガラスナノピペットの性質に依存することを見出した。また、脂質によっては、バイアス電圧100 mVで破壊されることもあることを確認した。光重合可能な脂質としてよく利用されるDiynePCの二重層膜にはCNTは挿入されなかった。そこで、複合脂質系に加え、他の脂質にも適用可能な脂質重合法も検討した。SICMの更なる高速化（高帯域化）には低ノイズ化が必須である。そこで、ガラスナノピペット外壁にアルミニウムの原子層を形成させ、低ノイズ化が期待される電気容量の低減化に成功した。Zピエゾ駆動に伴ってイオン電流に生ずるノイズの低減化についても、ピエゾ素子の静電遮蔽に加え、ノイズをキャンセルする信号を発生させるなどの工夫により、ノイズ低減化が進んだ。
生理的イオン環境を付与可能な微小膜環境の作成法についても、大きな前進があった。ビオチン結合能を有するタマビジンの二次元結晶をマイカ表面に直接形成させる条件検討を行った。その結果、タマビジンの二次元結晶がきれいに形成された。更には、種々の溶液を試したところ、二次元結晶に空隙結果を一度に多く生成させることにも成功した。この二次元結晶上にビオチン脂質を含む脂質平面膜を張ることにより空隙欠陥の上に宙に張られた膜が形成された。この微小な膜領域は非常に硬く、AFM探針との接触で0.1 nm程度しか歪まないことを確認した。この宙に張られた膜に膜タンパク質を導入できれば、膜タンパク質の高解像高速AFM観察が実現されると期待される。

今後の研究の推進方策

いくつかの技術的課題をクリアする必要はあると思うが、今のところ研究は順調に進展しており、少なくとも2018年度については当初の計画を変更する必要はほとんどないと考える。SICMの高解像化に向けたCNTプローブの作成は成功の見込みが高いと思われるため、高解像化に向けた第二の方策（ガラスナノピペットの先鋭化加工）にはしばらくは着手せずに、CNTプローブの作成に専念する。微小膜環境については、作成法がほぼ確立したと思われるため、精製膜タンパク質系のこのアッセイ系への組み込み試験を開始し、高速AFMによるイメージング実験を行う。

研究成果

• [国際共同研究] Lawrence Livermore National Laboratory/University of Michigan(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: Lawrence Livermore National Laboratory/University of Michigan
• [国際共同研究] KU Leuven-University of Leuven(Belgium)
  • 国名: ベルギー
  • 外国機関名: KU Leuven-University of Leuven
• [国際共同研究] Gdansk University of Technology(Poland)
  • 国名: ポーランド
  • 外国機関名: Gdansk University of Technology
• [国際共同研究] Shanghai Institute of Applied Physics(China)
  • 国名: 中国
  • 外国機関名: Shanghai Institute of Applied Physics
• [雑誌論文] Substrate protein dependence of GroEL-GroES interaction cycle revealed by high-speed AFM imaging (2018)
  • 著者名/発表者名: D. Noshiro and T. Ando
  • 雑誌名: Royal Society Philosophical Transactions B 巻: 373 ページ: 20170180-
  • DOI: 10.1098/rstb.2017.0180
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Real time monitoring of lipid exchange via fusion of peptide based lipid-nanodisc (2018)
  • 著者名/発表者名: T. Ravula, D. Ishikuro, N. Kodera, T. Ando, G. Anantharamaiah, A. Ramamoorthy
  • 雑誌名: Chemistry of Materials 巻: 印刷中 ページ: 印刷中
  • DOI: 10.1021/acs.chemmater.8b00946
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Quantum-dot antibody conjugation visualized at the single-molecule scale with high-speed aomic force microscopy (2018)
  • 著者名/発表者名: T. Umakoshi, H. Udaka, T. Uchihashi, T. Ando, M. Suzuki
  • 雑誌名: Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 巻: 167 ページ: 267-274
  • DOI: 10.1016/j.colsurfb.2018.04.015
  • 査読あり
• [雑誌論文] Insight into structural remodeling of the FlhA ring responsible for bacterial flagellar type III protein export (2018)
  • 著者名/発表者名: N. Terahara, Y. Inoue, N. Kodera, Y. V. Morimoto, T. Uchihashi, K. Imada, T. Ando, K. Namba, and T. Minamino
  • 雑誌名: Sci. Adv. 巻: 4 ページ: eaao7054
  • DOI: 10.1126/sciadv.aao7054
  • 査読あり
• [雑誌論文] Negatively charged lipids are essential for functional and structural switch of human 2-Cys peroxiredoxin II (2018)
  • 著者名/発表者名: T. Haruyama, T. Uchihashi, Y. Yamada, N. Kodera, T. Ando and H. Konno
  • 雑誌名: J. Mol. Biol. 巻: 430 ページ: 602-610
  • DOI: 10.1016/j.jmb.2017.12.020
  • 査読あり
• [雑誌論文] Dynamic clustering of dynamin-amphiphysin helices regulates membrane constriction and fission coupled with GTP hydrolysis (2018)
  • 著者名/発表者名: T. Takeda, T. Kozai, H. Yang, D. Ishikuro, K. Seyama, Y Kumagai, T. Abe, H. Yamada, T. Uchihashi, T. Ando, K. Takei
  • 雑誌名: e-Life 巻: 7 ページ: e30246
  • DOI: 10.7554/eLife.30246
  • 査読あり
• [雑誌論文] High-speed atomic force microscopy and its future prospects (2018)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 雑誌名: Biophys. Rev. 巻: 10 ページ: 285-292
  • DOI: 10.1007/s12551-017-0356-5
  • 査読あり
• [雑誌論文] High-speed atomic force microscopy (AFM (2018)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 雑誌名: Encyclopedia of Biophysics 巻: - ページ: 1-7
  • DOI: DOI: 10.1007/978-3-642-35943-9_478-1
  • 査読あり
• [雑誌論文] Real-space and real-time dynamics of CRISPR-Cas9 visualized by high-speed atomic force microscopy (2017)
  • 著者名/発表者名: M. Shibata, H. Nishimasu, N. Kodera, S. Hirano, T. Ando, T. Uchihashi & O. Nureki
  • 雑誌名: Nat. Commun. 巻: 8 ページ: 1430
  • DOI: 10.1038/s41467-017-01466-8
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Na+-induced structurak transition of MotPS for stator assembly of the Bacillus fragellar motor (2017)
  • 著者名/発表者名: N. Terahara, N. Kodera, T. Uchihashi, T. Ando, K. Namba, T Minamino
  • 雑誌名: Sci. Adv. 巻: 3 ページ: eaao4119
  • DOI: 10.1126/sciadv.aao4119
  • 査読あり
• [雑誌論文] High-speed atomic force microscopy imaging of live mammalian cells (2017)
  • 著者名/発表者名: M. Shibata, H. Watanabe, T. Uchihashi, T. Ando, R. Yasuda
  • 雑誌名: Biophys. Physicobiol. 巻: 14 ページ: 127-135
  • DOI: 10.2142/biophysico.14.0_127
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] High-speed XYZ nanopositioner for scanning ion conductance microscopy (2017)
  • 著者名/発表者名: S. Watanabe and T. Ando
  • 雑誌名: Appl. Phys. Lett. 巻: 111 ページ: 113106
  • DOI: 10.1063/1.4993296
  • 査読あり
• [雑誌論文] Directly watching biomolecules in action by high-speed atomic force microscopy (2017)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 雑誌名: Biophys. Rev. 巻: 9 ページ: 421-429
  • DOI: 10.1007/s12551-017-0281-7
  • 査読あり
• [雑誌論文] High-speed atomic force microscopy reveals loss of nuclear pore resilience as a dying code in colorectal cancer cells (2017)
  • 著者名/発表者名: M S Mohamed, A. Kobayashi, A. Taoka, T. Watanabe-Nakayama, Y. Kikuchi, M. Hazawa, T. Minamoto,Y. Fukumori, N. Kodera, T. Uchihashi, T. Ando, and R. W. Wong
  • 雑誌名: ACS Nano 巻: 11 ページ: 5567-5578
  • DOI: 10.1021/acsnano.7b00906
  • 査読あり
• [雑誌論文] Imaging modes of atomic force microscopy for application of molecular and cell biology (2017)
  • 著者名/発表者名: Y. F. Dufren, T. Ando, R. Garcia, D. Alsteens, D. Martinez-Martin, A. Engel, C. Gerber and D. J. Muller
  • 雑誌名: Nat. Nanotechnol. 巻: 12 ページ: 295-307
  • DOI: 10.1038/NNANO.2017.45
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] High-speed atomic force microscopy for observing protein molecules in dynamic action (2017)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 雑誌名: Proceedings of SPIE 巻: 10328 ページ: 103281R
  • DOI: 10.1117/12.2268795
  • 査読あり
• [学会発表] Dynamic GroEL-GroES interaction and its dependence on substrate protein (2018)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 学会等名: XX Linz Winter Workshop
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] High-speed atomic force microscopy: Visualizing protein molecules in action (2017)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 学会等名: Physics & Life Science Colloquium (Lawrence Livermore National Laboratory)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Structural analysis of IDPs by their visualization with high-speed AFM (2017)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 学会等名: CECAM Workshop on "Disordered protein segments: revisiting the structure-function paradigm"
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Special Lecture "Nano-visualization of protein molecules in action by high-speed AFM" (2017)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 学会等名: 15th International Conference on Na, K-ATPase and Related Transport ATPases
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Directly watching biomolecules in action by high-speed atomic force microscopy (2017)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 学会等名: 19th IUPAB Congress & 11th EBSA Congress
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Direct visualization of biological nanomachines in action by high-speed AFM (2017)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 学会等名: 9th International Conference on Engineering of Chemical Complexity
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Dynamic GroEL-GroES interaction revealed by high-speed atomic force microscopy (2017)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 学会等名: Royal Society Discussion Meeting on Allostery and Molecular Machines
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] High-speed atomic force microscopy and its future prospects (2017)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 学会等名: 19th International Scanning Probe Microscopy Conference
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Keynote speech "High-speed AFM for filming protein molecules in action" (2017)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 学会等名: 8th International Conference on Advanced Materials and Nanotechnology
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 特別講演「タンパク質分子の機能動態を直接撮影する高速AFM」 (2017)
  • 著者名/発表者名: 安藤敏夫
  • 学会等名: 日本薬学会「生体膜と薬物の相互作用」シンポジウム
  • 招待講演
• [備考] Welcome to Kanazawa Biophysics Lab
  • URL: http://biophys.w3.kanazawa-u.ac.jp/
• [備考] Nano LSI WPI Kanazawa University
  • URL: https://nanolsi.kanazawa-u.ac.jp/en/
• [備考] 金沢大学 生物物理学研究室にようこそ
  • URL: http://biophys.w3.kanazawa-u.ac.jp/index_J.htm
• [備考] 金沢大学ナノ生命科学研究所
  • URL: https://nanolsi.kanazawa-u.ac.jp/