極めて柔らかい膜環境にあるタンパク質分子のナノ動態イメージングの実現

2019 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H06121
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 安藤 敏夫 金沢大学, ナノ生命科学研究所, 特任教授 (50184320)
• 研究期間 (年度): 2017-05-31 – 2022-03-31
• キーワード: 膜蛋白質 / 高速AFM / 走査型イオン伝導顕微鏡 / バイオイメージング

研究実績の概要

代表者が開発した高速AFMは既に広く利用され、様々な蛋白質分子の動態観察研究が進んでいる。しかしそれでもなお、高速AFM観察できない試料系、現象が未だ多く存在する：生理的環境下にある精製膜蛋白質系、柔らかい高次構造体にある蛋白質分子のその場観察、細胞内の観察。そこで、以下の三課題を実施してきた。
①膜表裏の間に非対称な環境を形成できるアッセイ系の実現
②非接触イメージング可能な走査型イオン伝導顕微鏡（SICM）の高速化と高解像化、及び、その両立
③高速AFMにおける探針－試料間接触力の更なる低減化
①については、 (i) ガラスキャピラリー先端に膜を張り、高速AFM観察する方法、(ii) 基板に凹凸を形成させ、その表面に膜を張る方法を検討し、更に、(iii)膜剥離細胞の調製法を検討した。 (i)については先端部の高速AFMイメージングを既に成功させているが、新たにキャピラリー内外に電極を設置し、キャピラリー先端での膜形成をイオン電流の減少からモニターできるようになった。(ii)については、スパッタにより微粒子を数十nmの間隔で基板にコートする方法を見出した。実際に、このアッセイ系で膜蛋白質の観察に成功した。(iii)については多くの細胞内構造をインタクトに保つまでにはなっていない。②については、従来に比べ100倍以上の高速化を達成した（論文発表）。解像度を上げるためにCNTを利用する方法を検討してきたが、成功確率が低くルーチンで利用できるまでになっていない。そこで、レーザープラーのパラメータを検討し、開口半径1-3nmを達成した。高速性と高解像の両立については、開口径に依存しない拡散電位でもイメージングできることを見出した。③については、Z-スキャナー、振幅計測を数倍速くすることに成功し、また、ラスター走査を工夫することで低侵襲性能を飛躍的に向上させることに成功した。

現在までの達成度 (区分)

2: おおむね順調に進展している

理由

いずれの研究課題も当初の目標に向け順調に進展している。予定していた手法がうまく行かない場合でも、第二、第三の手法を検討し、目標に近づくことができている。例えば、CNTを利用したSICM用ピペットの作成は成功確率が低いという問題があり未だ日常的に利用できる段階にないが、レーザープラーのパラメータを種々検討することにより、壁厚が3-6nmと薄く直径5nm以下の開口を有するナノピペットをルーチンで作成できるようになった。このような薄いガラス壁と微小孔をもつナノピペットの透過電顕による解析は電子ビームによる熱発生のため困難だが、この問題を克服する方法を開発し、利用している。また、このような微小ナノピペットに電解質を一様に充填することも非常に困難だが、これを克服する方法を見出した（論文発表）。膜表裏の間に非対称環境を持たせることができるアッセイ系の開発でも、当初予定していた方法に加え、別の手法を検討した結果、それぞれ特徴のあるアッセイ系をある程度開発できている。膜剥離細胞の調製でも、超音波法に加え、界面活性剤や両親媒性ペプチドなどの利用により、少なくとも細胞質膜の内側に結合しているクラスリンコート小胞やサルコメア様ストレスファイバーといった構造体を無傷のまま残し、それらの高速AFMによるその場観察にも成功している。高速SCIMの開発も順調に進展し、解像性能を落とさずに世界最速の性能を実現した（論文発表）。更に、イオン電流とは違い開口径に依存しない拡散電位もイメージングに利用できることを見出している。高速AFMにおける探針・試料間接触力の更なる低減化は当初予定しなかった課題だが、期待した以上の低侵襲性と高速性が達成され、更なる飛躍への第一歩となった。

今後の研究の推進方策

いずれの課題も順調に推移しているため、当初の研究目的を達成できるものと見込んでいる。インパクトのある実証研究と応用研究の成果を多く出せるかはマンパワーや共同研究の機会によるため予想できないが、研究期間内には2-3は出せるものと予想している。
●膜蛋白質の生理環境下での動態を高速AFM観察するために構築してきたアッセイ系は、おそらくいずれも利用可能と見込んでいる。膜蛋白質MsbAでは、MsbA内部を移動してきたLipid AがMsbAの膜貫通ドメインにある中心孔から出てくる様子や、輸送と共役したATPase反応で駆動される動的構造変化を捉えられると期待している。膜結合蛋白質LSOについてはかなり研究が進んだ。だが、従来のアッセイ系では観察できなかった問題、すなわち、SLOにより切り取られた膜で形成される小胞がSLOリングの上面或いは下面のどちらから抜け出て孔が最終的に形成されるかという未解決問題を解決できると見込んでいる。学内外の膜蛋白質に詳しい研究者との共同研究も視野に入れている。
●SICMの高速化と高解像化の両立は非常に挑戦的な課題だが、この検討のために装置の改造を現在進めている。これが完了次第、両立させるためのアイデアを実行に移す。具体的には、負に帯電したナノピペットのガラス壁を正電荷を有するシランなどで中和し、ナノピペットに正・負電荷の移動度が異なる電解質（NaClやLiClなど）を充填し、拡散電位計測によりイメージング可能か検討する。また、電荷の再配置にかかる時間をガラス壁の電荷中和により短縮できるかを検討する。
●高速AFMの高速性と低侵襲性の改善は、現在の進捗状況から判断してかなり進展するものと見込んでいる。脆弱なタンパク質系を壊さずに最低でも毎秒30フレームの速度でイメージングできるものと見込んでいる。ひょっとすると、毎秒50フレームの速度まで行くかもしれない。

研究成果

• [国際共同研究] Max Planck Institute/University of Freiburg(ドイツ)
  • 国名: ドイツ
  • 外国機関名: Max Planck Institute/University of Freiburg
• [国際共同研究] Monash University(カナダ)
  • 国名: カナダ
  • 外国機関名: Monash University
• [国際共同研究] Central South University(中国)
  • 国名: 中国
  • 外国機関名: Central South University
• [国際共同研究] University of Michigan(米国)
  • 国名: 米国
  • 外国機関名: University of Michigan
• [雑誌論文] Phase separation organizes the site of autophagosome formation (2020)
  • 著者名/発表者名: Y. Fujioka, J. Md. Alam, D. Noshiro, K. Mouri, T. Ando, Y. Okada, A. I. May, R. L. Knorr, K. Suzuki, Y. Ohsumi, N. N. Noda
  • 雑誌名: Nature 巻: 678 ページ: 301-305
  • DOI: 10.1038/s41586-020-1977-6
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] High-speed near-field fluorescence microscopy combined with high-speed atomic force microscopy for biological studies (2020)
  • 著者名/発表者名: T. Umakoshi, S. Fukuda, R. Iino, T. Uchihashi, T. Ando
  • 雑誌名: BBA-Gneral Subjeccts 巻: 1864 ページ: 129325 (10 pp)
  • DOI: 10.1016/j.bbagen.2019.03.011
  • 査読あり
• [雑誌論文] Development of high-speed ion conductance microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: S. Watanabe, S. Kitazawa, L. Sun, N. Kodera, T. Ando
  • 雑誌名: Rev. Sci. Instrum. 巻: 90 ページ: 123704 (14 pp)
  • DOI: 10.1063/1.5118360
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structure of the mitochondrial import gate reveals distinct preprotein paths (2019)
  • 著者名/発表者名: Y. Araiso, A. Tsutsumi, J. Qiu, K. Imai,T. Shiota, J. Song, C. Lindau, L.-S. Wenz, H. Sakaue, K. Yunoki, S. Kawano, J. Suzuki, M. Wischnewski, C. Schütze, H. Ariyama, T. Ando, T. Becker, T. Lithgow, N. Wiedemann, N. Pfanner, M. Kikkawa, T. Endo
  • 雑誌名: Nature 巻: 575 ページ: 395-401
  • DOI: 10.1038/s41586-019-1680-7
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Thermally driven approach to fill sub-10-nm pipettes with batch production (2019)
  • 著者名/発表者名: L. Sun, K. Shigyou, T. Ando, S. Watanabe
  • 雑誌名: Anal. Chem. 巻: 91 ページ: 14080-14084
  • DOI: 10.1021/acs.analchem.9b03848
  • 査読あり
• [雑誌論文] High-speed atomic force microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 雑誌名: Curr. Opin. Chem. Biol. 巻: 51 ページ: 105-112
  • DOI: 10.1016/j.cbpa.2019.05.010
  • 査読あり
• [雑誌論文] Structural insights into the substrate specificity switch mechanism of the type III protein export apparatus (2019)
  • 著者名/発表者名: Y. Inoue, Y. Ogawa, M. Kinoshita, N. Terahara, M. Shimada, N. Kodera, T. Ando, K. Namba, A. Kitao, K. Imada, T. Minamino
  • 雑誌名: Sttucture 巻: 27 ページ: 965-976
  • DOI: 10.1016/j.str.2019.03.017
  • 査読あり
• [雑誌論文] Cationic polymethacrylate-copolymer acts as an agonist for β-amyloid and antagonist for amylin fibrillation (2019)
  • 著者名/発表者名: B. R. Sahoo, T. Genjo, T. Watanabe-Nakayama, A. K. Stoddard, T. Ando, K. Yasuhara, C. A. Fierke, A. Ramamoorthy
  • 雑誌名: Chem. Sci. 巻: 10 ページ: 3976-3986
  • DOI: 10.1039/C8SC05771K
  • 査読あり / 国際共著
• [雑誌論文] Inner lumen proteins stabilize doublet microtubules in cilia and flagella (2019)
  • 著者名/発表者名: M. Owa, T. Uchihashi, H. Yanagisawa, T. Yamano, H. Iguchi, H. Fukuzawa, K. Wakabayashi, T. Ando, and M. Kikkawa
  • 雑誌名: Nat. Commun. 巻: 10 ページ: 1143 (10 pp)
  • DOI: 10.1038/s41467-019-09051-x
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Metastable asymmetrical structure of shaftless V1 motor (2019)
  • 著者名/発表者名: S. Maruyama, K. Suzuki, M. Imamura, H. Sasaki, H. Matsunami, K. Mizutani, Y. Saito, F. L. Imai, Y. Ishizuka-Katsura, T. Kimura-Someya, M. Shirouzu, T. Uchihashi, T. Ando, I. Yamato, T. Murata
  • 雑誌名: Sci. Adv. 巻: 5 ページ: eaau8149(10pp)
  • DOI: 10.1126/sciadv .aau8149
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Single-unit imaging of membrane protein-embedded nanodiscs from two oriented sides by high-speed atomic force microscopy (2019)
  • 著者名/発表者名: T. Haruyama, Y. Sugano, N. Kodera, T. Uchihashi, T. Ando, Y. Tanaka, H. Konno, and T. Tsukazaki
  • 雑誌名: Structure 巻: 27 ページ: 152-160
  • DOI: 10.1016/j.str.2018.09.005
  • 査読あり
• [雑誌論文] 高速AFMの現状と将来展望 (2019)
  • 著者名/発表者名: 安藤敏夫
  • 雑誌名: 顕微鏡 特集号 高速AFM観察が可能にした菌細胞のリアルタイム構造変化 巻: 54 ページ: 56-61
  • 査読あり
• [学会発表] High-speed AFM revealing dynamic biomolecular processes (2020)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 学会等名: Biophysical Society Annual Meeting: Nanoscale Approaches to Biology Subgroup meeting (San Diego, USA)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Early preautophagosomal structure is formed by liquid-liquid phase separation through weak intermolecular interactions between Atg 13 and Atg17 (2020)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 学会等名: XXII Linz Winter Workshop (Bio-AFM Workshop (Johannes Kepler University Linz, Linz Austria)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Keynote speech "High-speed AFM in Bio-Med: Its current state and future prospects" (2019)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 学会等名: AFM BioMed Conference 2019 (Münster, Germany)
• [学会発表] High-speed AFM (2019)
  • 著者名/発表者名: T. Ando
  • 学会等名: Keystone Symposia Conference: Imaging across scales leveraging the revolution in resolution. (Snowbird, Utah, USA)
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Direct visualization of protein molecules during their functional activity (2019)
  • 著者名/発表者名: 安藤敏夫
  • 学会等名: 蛋白質科学会・シンポジウム「蛋白質科学の新常識：ナノスケールから細胞まで」
  • 招待講演
• [図書] 高速AFMの技術革新と注目の成果 in 実験医学増刊 Vol.38 No.5 イメージング時代の構造生命科学 (2020)
  • 著者名/発表者名: 安藤敏夫
  • 総ページ数: 8 pp (248 pp)
  • 出版者: 羊土社
  • ISBN: 978-4-7581-0385-5
• [図書] Direct imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy", a chapter in Molecular Motor (Methods in Molecular Biology) (2019)
  • 著者名/発表者名: N. Kodera and T. Ando
  • 総ページ数: 20 pp (452 pp)
  • 出版者: Springer
  • ISBN: 978-1-4939-8554-8
• [備考] 液－液相分離がオートファジーを制御する仕組みを発見 ～オートファジー研究は次のフェーズへ～
  • URL: https://nanolsi.kanazawa-u.ac.jp/post-9787/
• [備考] ミトコンドリアへのタンパク質搬入口TOM複合体の精密構造と働く仕組みを解明
  • URL: https://nanolsi.kanazawa-u.ac.jp/achievements/achievements-8472/
• [備考] 世界初！細菌べん毛タンパク質輸送の交通整理のしくみを解明
  • URL: https://nanolsi.kanazawa-u.ac.jp/achievements/achievements-2184/
• [備考] 金沢大学の研究：ピペットを完全に満たす
  • URL: https://www.prnewswire.com/news-releases/kanazawa-university-research-complete-filling-of-batches-of-nanopipettes-300979509.html
• [備考] 解像度を下げずにSICMのスピードを上げる
  • URL: http://biophys.w3.kanazawa-u.ac.jp/paper/Scilight-RSI-2019.pdf