研究課題
胎児期の生殖細胞において、NANOS2およびDND1が標的遺伝子を認識して発現抑制を行うことは明らかであるが、その詳細な分子機構はまだ不明であった。培養細胞にNANOS2の標的遺伝子であるDazl及びSohlh2の3'-UTRを結合させ、かつMS2の認識配列を有したmRFPレポーターを発現させて、実際にNANOS2およびDND1がどのように標的遺伝子を認識し、機能するかを解析した。その結果、NANOS2は自分のRNA結合ドメインを介して標的RNAを結合したDND1を認識して結合すること。また標的1RNAの認識にはDND1のみでは不十分であり、NANOS2もその認識段階に関与することがNANOS2-DND1融合タンパク質の変異体解析により明らかになった。NANOS２の下流で雄性文化に直接関与する遺伝子の探索を行った、NANOS2のエンハンサーに遺伝子を結合して、雄で強制発現させることにより、雄性化を抑制する遺伝子候補が得られた。GS細胞を用いてFlag-NANOS3を条件付きでKOできる細胞を確立した。そのRNA-seq解析結果は、in vivoの解析結果を反映することが明らかになった。この系を用いて、NANOS3のインタラクターおよび、標的遺伝子候補を同定した。生殖細胞の雄化モデルとしてSMAD4-cKO/RA阻害剤処理マウスの生殖細胞を単離し、シングルセル解析を行った。E13.5における他の遺伝子型と比較して、雄化に向かう特徴的な細胞が同定できた。
2: おおむね順調に進展している
NANOS2の下流で機能する細胞分裂制御因子としてmTORC1系の因子、TSC2およびNrpl2を同定した。これらの因子は培養細胞において、mTORC系を制御することが確認できた。ES細胞を用いて、それぞれの因子の条件付きKOを作成し、キメラ解析により、興味深い結果が得られている。しかし、やはりコンスタントに解析するには、マウスラインの確立が必要である。現在、TSC2およびNrpl2のcKOマウスラインを確立中である。また雄性化にかかわる因子に関しても候補が得れらてれおり、現在、DOXを用いた強制発現系マウスを作成中である。タンパクノックダウン系を確立するためにAID-tagをNANOS2, CNOT1, DDX6, DCP2遺伝子座にノックインしたマウスの確立に成功した。
胎児期の生殖細胞の分化制御にかかわるRNA制御因子の機能解析をおこなっているが、遺伝子をノックアウトしてもタンパク質が維持されており、解析が不可能である場合が多い。特にNANOS2, CNOT1, DCP2など非常に重要なタンパク質は安定であることが明らかになった。今後オーキシンデグロン系を用いたタンパク分解系が重要になると考えられる。まずその系を確立するために必要なマウスの系を確立する。一方、強制発現系はDOX系を利用する、NANOS2のエンハンサーで機能する、rtTA発現マウスを確立するとともに、発現誘導する遺伝子はROSAあるいはTigre遺伝子座に導入する。
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すべて 雑誌論文 (3件) (うち査読あり 3件、 オープンアクセス 3件)
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