| 研究課題/領域番号 |
17H06169
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| 研究機関 | 富山県立大学 |
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研究代表者 |
浅野 泰久 富山県立大学, 工学部, 教授 (00222589)
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| 研究分担者 |
日比 慎 富山県立大学, 工学部, 准教授 (30432347)
松井 大亮 富山県立大学, 工学部, 助教 (40748513)
山口 拓也 筑波大学, 生命環境系, 助教 (00748527)
中野 祥吾 静岡県立大学, 食品栄養科学部, 助教 (80748541)
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| 研究期間 (年度) |
2017-05-31 – 2022-03-31
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| キーワード | 節足動物 / ヒドロキシニトリルリアーゼ |
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| 研究実績の概要 |
課題１ １．異種発現系（大腸菌）で不溶性にしか発現しない酵素の探索について、Thermus thrmophilus由来ORFomeや酵母、植物、動物由来のアミノ酸代謝関連酵素の異種発現系の構築を行った。それらの培養や誘導条件を統一し、比較した。SDS-PAGEによると活性測定によるスクリーニング手法を検討した。2．同時に複数の遺伝子に変異導入するため、形質転換するだけでプラスミド中に変異が導入される大腸菌XL-1Redを利用した。また培地などの分注機械やコロニーピッカーなどを利用して、ハイスループットスクリーニング系を検討した。また抗生物質耐性遺伝子を用いたin vivoスクリーニング系についても検討した。3．大腸菌で不溶性にしか発現しない多数のタンパク質に変異を導入し可溶性に発現する例を得た。それらの配列情報を基に変異が入っている箇所を比較した結果、αヘリックス構造上に比較的多く変異が挿入されていることを明らかにした。またそれらにおいて、アミノ酸の保存性とも関連していることが明らかとなった。4．「INTMSAlign-HiSol」を用いる推定法を検討した。微生物酵素・タンパク質について実証例を多数集めて法則性の一般化を開始した。
課題２ 1．静岡、鹿児島でのヤスデの採捕、質量分析器の整備、糖鎖解析を行った。2017年秋に大発生したヤスデDNAについてゲノム解読作業を開始した。2．ヤスデ由来HNL類の結晶構造解析と反応機構の解明： ChuaHNLのX-線構造解析を行った。さらに各種のヤスデのHNL遺伝子のクローニングと発現を試み、いくつかの遺伝子を大腸菌でも発現できた。3．タンパク質工学によるHNL類の改変：ストレッカー反応を触媒する酵素の活性を検出するため、ニトリルの分解反応を測定するため96穴プレートリーダーや、合成反応のためのHPLC法を確立した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
課題１ 1．これまでにThermus thrmophilus由来タンパク質全937種類中85種が不溶性発現することを明らかにした。また酵母は全8種類中2種が不溶性発現、植物は全11種類中2種類が不溶性発現、動物は全23種類中12種類が不溶性発現することを明らかにした。さらにそれぞれの活性測定を確立することで、培養から活性測定までの一連の操作を確立できた。2．有効な変異導入法と迅速なスクリーニング法の確立：大腸菌XL-1REDを用いて、変異を導入する簡易な手法を用いることで、同時に複数の遺伝子に変異を導入できた。さらに、コロニーピッカーや抗生物質耐性遺伝子を用いたスクリーニング系を確立した。3．新しい可溶性変異の発見：いくつかの変異体を取得した。それらの結果から、これまで見出されていなかったαヘリックスに変異が挿入されているといった傾向などを明らかにできた。4. 独自に開発したINTMS-Alignを用いて変異導入し、いくつか可溶性に発現する変異型酵素を見出した。
課題２ 1． ヤスデ由来HNL類の結晶構造解析と反応機構の解明：静岡、鹿児島でのヤスデの採捕、質量分析器の整備、糖鎖解析を行った。2017年秋に大発生したヤスデDNAについてゲノム解読作業を開始した。2. ChuaHNLのX-線構造解析を行った。さらに各種のヤスデのHNL遺伝子のクローニングと発現を試み、いくつかの遺伝子が大腸菌でも発現できた。3．タンパク質工学によるHNL類の改変：フェニルグリシノニトリルなどのアミノニトリルの分解反応をプレートリーダーで簡易に測定する方法を確立することで、同時に他サンプルの酵素活性の反応を測定でき、スクリーニングなどに今後利用できることを明らかにした。またアミノニトリルの立体をHPLCで分離して分析する手法を確立した。
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| 今後の研究の推進方策 |
課題１ 1．異種発現系（大腸菌）で不溶性にしか発現しない酵素の探索を継続する。2．現象を発見しやすい、電気泳動ゲルレベルあるいはHis-Tag抗体検出のハイスループットスクリーニング系を検討する。また、Tat-split-GFP法を開発する。「α-ヘリックス則」のプログラム化を行い、INTMSAlignと効率的に連結できるようにする。また、INTMSAlignを補足する新しい改良プログラムを開発する。他の大学や会社と連携して、可溶性発現の実例について成功例を増やす。
課題２ 1. ヤスデのゲノムシークエンスデータを解析する。さらにゲノム上の遺伝子を推定し、シアン代謝などに関与する遺伝子を見出す。2. 結晶構造解析を他のヤスデの酵素でも行えるようにする。3. これまで研究室で10数年にわたって蓄積して来た植物、動物由来のHNLを用いて分解活性及び合成活性を調査する。また、フェニルグリシノニトリルだけでなく、その他のアミノニトリルを化学合成し、それらを基質として分解反応や合成反応を検討する。
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