カニクイザルを用いた遺伝性網膜疾患モデルの作製：病態機序の解明と治療法の開発

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H06276
• 研究機関: 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター)
• 研究代表者: 岩田 岳 独立行政法人国立病院機構(東京医療センター臨床研究センター), 分子細胞生物学研究部, 部長 (90374157)
• 研究分担者: 溝田 淳 帝京大学, 医学部, 教授 (10239262) ; 下澤 律浩 国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所, 医薬基盤研究所 霊長類医科学研究センター, 主任研究員 (50300786)
• 研究期間 (年度): 2017-06-30 – 2020-03-31
• キーワード: 医歯薬学 / 外科系臨床医学 / 眼科学 / 眼生化学・分子生物学 / ドルーゼン

研究実績の概要

ヒトは情報の約8割を視覚情報に頼っており、これが障害されると通常の生活に著しい影響を及ぼす。日本人の主な失明原因である緑内障、加齢黄斑変性、一部の遺伝性網膜疾患はヒトを含む高等霊長類にのみ存在する眼球部位で発症しており、通常使われる実験動物（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタなど）ではより厳密な疾患モデル動物を作製することは困難である。また、多くの眼疾患はゲノム配列と強く相関しており、原因遺伝子や感受性遺伝子は眼疾患のリスク因子として作用する。眼疾患と関連するゲノム配列を高等霊長類で再現することが可能になれば、ヒトの眼疾患を再現し、病態の解明や治療法の開発に必要な動物モデルとして利用できる。本研究は最新のCRISPR/Cas9遺伝子改変技術をヒトと眼球構造がきわめて類似するカニクイザルに応用し、ヒトの難治性眼疾患を再現して、病態の解明や治療法の開発に利用することを目的とする。緑内障、加齢黄斑変性、遺伝性網膜疾患に関わる遺伝子のノックインカニクイザルの作製をめざす。この研究によって、より患者の病態に近い眼疾患モデル動物の作製が期待され、これまでのマウスを中心とした遺伝子解析動物よりも精度の高い情報が得られると期待される。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

カニクイザルモデルに対してGnRH agonist、FSHおよびhCGを用いたホルモン投与方法により成熟卵の採取を行ったところ、成熟卵採取において効果的に採取できたり、あるいはできなかったことがあった。カニクイザルではマウスの系統とは異なり、遺伝的背景が揃っていないことや個体の年齢や状態も個々に異なることによって、適した採卵方法ではない可能性が示唆された。また、採卵個体の体重変化において、GnRH agonist投与開始から採卵時までのおよそ一ヶ月の間に、顕著な減少が見られ、本採卵方法による個体の健康状態への影響が考えられた。一方、GnRH antagonistを利用したホルモン投与方法では、GnRH agonistを用いた場合よりも投与から採卵までの期間の短縮および体重減少がほとんど見られないことから、より効率的な卵採取が可能と考えられた。卵数が十分に準備でき、その質に問題がないと確認されたときに顕微授精によって受精卵の作成を行った。その結果作出された前核期受精卵の細胞質中に黄斑ジストロフィの病因遺伝子（A遺伝子とする）あるいは網膜色素変性の病因遺伝子（B遺伝子とする）を改変するように設計されたCRISPR/CAS9タンパク質あるいはmRNAおよびgRNAを同時に微量注入した。注入された前核期受精卵を体外培養後、正常に分割した質の良いと考えられる受精卵を仮腹となる雌カニクイザルへ胚移植を行った。胚移植後約１ヶ月に超音波画像診断により妊娠を確認した。また、一部の注入胚においては、体外培養の継続後、胚盤胞への発生が確認された。

今後の研究の推進方策

昨年度よりCas9のmRNAとタンパク質の両方で個々に胚注入を行ってきたが、タンパク質は凍結できないために、gRNAなどと別途注入が必要であった。マウスとは異なり、カニクイザルでは受精卵を数百単位で準備することは困難であり、今後はCas9 mRNAを中心にgRNAと混合物を適当濃度に調整して、注入受精卵数を増加させたい。妊娠中の胎児おいて遺伝子改変が行われているか否かを確認するために、妊娠中に羊水を採取し、ここからゲノムDNAを抽出し、目的遺伝子が改変されているか否かを確認したものの遺伝子検査をPCR、PCR産物のTAクローニング、およびDNAシークエンスによって実施した。出産時においても胎児由来産物（血液や胎盤など）をサンプルとした遺伝子検査を行い、羊水DNAサンプルとの一致を確認した。残念ながらゲノム編集後に複数個体が生まれているが、目的とする遺伝子改変カニクイザルは作製されていない。作製されれば、哺育および生育状況を見ながら対象個体の眼底観察を実施する。また、成熟卵を採取する方法としてGnRH agonist、FSHおよびhCGを用いたホルモン投与方法に加え、GnRH antagonistを用いた方法あるいはhCG投与から採卵までの時間について卵採取法を行い、受精卵作成の効果や採卵個体への影響について検討する。A遺伝子およびB遺伝子の改変を平行して実施し、CRISPR/CAS9注入胚の胚移植を実施するとともに、胚移植を行わなかった胚において、遺伝子改変の有無を解析する。また一部の胚においては、発生した胚盤胞から内部細胞塊を摘出し、ES細胞の樹立を計る。

研究成果

• [雑誌論文] Novel biallelic loss-of-function KCNV2 variants in cone dystrophy with supernormal rod responses. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kutsuma T, Katagiri S, Hayashi T, Yoshitake K, Iejima D, Gekka T, Kohzaki K, Mizobuchi K, Baba Y, Terauchi R, Matsuura T, Ueno S, Iwata T, Nakano T.
  • 雑誌名: Doc Ophthalmol. 巻: 138(3) ページ: 229-239
  • DOI: 10.1007/s10633-019-09679-6.
  • 査読あり
• [雑誌論文] High-Resolution Retinal Imaging Reveals Preserved Cone Photoreceptor Density and Choroidal Thickness in Female Carriers of Choroideremia. (2019)
  • 著者名/発表者名: Suzuki K, Gocho K, Akeo K, Kikuchi S, Kubota D, Katagiri S, Fujinami K, Tsunoda K, Iwata T, Yamaki K, Igarashi T, Nakano T, Takahashi H, Hayashi T, Kameya S.
  • 雑誌名: Ophthalmic Surg Lasers Imaging Retina. 巻: 50(2) ページ: 76-85
  • DOI: 10.3928/23258160-20190129-03.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Novel mutations in the RS1 gene in Japanese patients with X-linked congenital retinoschisis. (2019)
  • 著者名/発表者名: Kondo H, Oku K, Katagiri S, Hayashi T, Nakano T, Iwata A, Kuniyoshi K, Kusaka S, Hiyoshi A, Uchio E, Kondo M, Oishi N, Kameya S, Mizota A, Naoi N, Ueno S, Terasaki H, Morimoto T, Iwaki M, Yoshitake K, Iejima D, Fujinami K, Tsunoda K, Shinoda K, Iwata T.
  • 雑誌名: Hum Genome Var. 巻: 6 ページ: 3; 1-6
  • DOI: 10.1038/s41439-018-0034-6.
  • オープンアクセス
• [雑誌論文] Clinical findings of end-stage retinitis pigmentosa with a homozygous PDE6A variant (p.R653X). (2019)
  • 著者名/発表者名: Mizobuchi K, Katagiri S, Hayashi T, Yoshitake K, Fujinami K, Kuniyoshi K, Mishima R, Tsunoda K, Iwata T, Nakano T.
  • 雑誌名: Am J Ophthalmol Case Rep. 巻: 13 ページ: 110-115
  • DOI: 10.1016/j.ajoc.2018.12.019.
• [雑誌論文] Three cases of acute-onset bilateral photophobia. (2019)
  • 著者名/発表者名: Ueno S, Inooka D, Meinert M, Ito Y, Tsunoda K, Fujinami K, Iwata T, Ohde H, Terasaki H.
  • 雑誌名: Jpn J Ophthalmol. 巻: 63(2) ページ: 172-180
  • DOI: 10.1007/s10384-018-00649-0.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Compound heterozygous splice site variants in the SCLT1 gene highlight an additional candidate locus for Senior-Loken syndrome. (2018)
  • 著者名/発表者名: Katagiri S, Hayashi T, Yoshitake K, Murai N, Matsui Z, Kubo H, Satoh H, Matsufuji S, Takamura T, Yokoo T, Omori Y, Furukawa T, Iwata T, Nakano T.
  • 雑誌名: Sci Rep. 巻: 8 ページ: 16733
  • 査読あり
• [雑誌論文] CHANGES OF CONE PHOTORECEPTOR MOSAIC IN AUTOSOMAL RECESSIVE BESTROPHINOPATHY. (2018)
  • 著者名/発表者名: Nakanishi A, Ueno S, Hayashi T, Katagiri S, Ito Y, Kominami T, Fujinami K, Tsunoda K, Iwata T, Terasaki H.
  • 雑誌名: Retina. 巻: 218 ページ: 1782-1787
  • DOI: 10.1097/IAE.0000000000002363.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Optineurin E50K triggers BDNF deficiency-mediated mitochondrial dysfunction in retinal photoreceptor cell line. (2018)
  • 著者名/発表者名: Shim MS, Kim KY, Noh M, Ko JY, Ahn S, An MA, Iwata T, Perkins GA, Weinreb RN, Ju WK.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 巻: 503(4) ページ: 2690-2697
  • DOI: 10.1016/j.bbrc.2018.08.025.
  • 査読あり
• [雑誌論文] KUS121, an ATP regulator, mitigates chorioretinal pathologies in animal models of age-related macular degeneration. (2018)
  • 著者名/発表者名: Muraoka Y, Iida Y, Ikeda HO, Iwai S, Hata M, Iwata T, Nakayama M, Shimozawa N, Katakai Y, Kakizuka A, Yoshimura N, Tsujikawa A.
  • 雑誌名: Heliyon. 巻: 4(5) ページ: e00624
  • DOI: 10.1016/j.heliyon.2018.e00624.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Effect of Timolol on Optineurin Aggregation in Transformed Induced Pluripotent Stem Cells Derived From Patient With Familial Glaucoma. (2018)
  • 著者名/発表者名: Inagaki S, Kawase K, Funato M, Seki J, Kawase C, Ohuchi K, Kameyama T, Ando S, Sato A, Morozumi W, Nakamura S, Shimazawa M, Iejima D, Iwata T, Yamamoto T, Kaneko H, Hara H.
  • 雑誌名: Invest Ophthalmol Vis Sci. 巻: 59(6) ページ: 2293-2304
  • DOI: 10.1167/iovs.17-22975.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] LRRTM4-C538Y novel gene mutation is associated with hereditary macular degeneration with novel dysfunction of ON-type bipolar cells. (2018)
  • 著者名/発表者名: Kawamura Y, Suga A, Fujimaki T, Yoshitake K, Tsunoda K, Murakami A, Iwata T.
  • 雑誌名: J Hum Genet. 巻: 63(8) ページ: 893-900
  • DOI: 10.1038/s10038-018-0465-4.
  • 査読あり
• [雑誌論文] POSTERIOR STAPHYLOMAS IN EYES WITH RETINITIS PIGMENTOSA WITHOUT HIGH MYOPIA. (2018)
  • 著者名/発表者名: Xu X, Fang Y, Yokoi T, Shinohara K, Hirakata A, Iwata T, Tsunoda K, Jonas JB, Ohno-Matsui K.
  • 雑誌名: Retina. 巻: 218 ページ: 1064-1070
  • DOI: 10.1097/IAE.0000000000002180.
  • 査読あり
• [雑誌論文] Early onset flecked retinal dystrophy associated with new compound heterozygous RPE65 variants. (2018)
  • 著者名/発表者名: Katagiri S, Hosono K, Hayashi T, Kurata K, Mizobuchi K, Matsuura T, Yoshitake K, Iwata T, Nakano T, Hotta Y.
  • 雑誌名: Mol Vis. 巻: 24 ページ: 286-296
  • 査読あり
• [雑誌論文] Autosomal dominant retinitis pigmentosa with macular involvement associated with a disease haplotype that included a novel PRPH2 variant (p.Cys250Gly). (2018)
  • 著者名/発表者名: Katagiri S, Hayashi T, Mizobuchi K, Yoshitake K, Iwata T, Nakano T.
  • 雑誌名: Ophthalmic Genet. 巻: 39 ページ: 357-365
  • DOI: 10.1080/13816810.2018.1459737.
  • 査読あり
• [学会発表] Update on the Global Eye Genetics Consortium (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Iwata
  • 学会等名: XIVth Biennial SAARC Academy of Opththalmology (SAO) Conference
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Establishment of Asian Eye Genetics Consortium (AEGC, http://asiangenetics.) by 20 countries (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Iwata
  • 学会等名: XIVth Biennial SAARC Academy of Opththalmology (SAO) Conference
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Identifying novel genes for hereditary retinal diseases and development of drug for glaucoma from the Japan Eye Genetics Consortium (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Iwata
  • 学会等名: XIVth Biennial SAARC Academy of Opththalmology (SAO) Conference
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Asia and the Global Eye Genetics Consortium: A research based consortium for advances in vision research (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Iwata
  • 学会等名: he Founding Conference of the Global Eye Genetics Consortium （GEGC）Chinese Branch & The First Academic Confernce on Eye Genetics Disease
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] [KEY NOTE TALK]Neuroprotection of Optineurin E50K Knok-in Mice with Normal Tension Glaucoma by TBK1 Inhibitor Amlexanox (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Iwata
  • 学会等名: ARVO India 2018
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Animal Models for Eye Diseases (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Iwata
  • 学会等名: ARVO India
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Age-related Macular Degeneration (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Iwata
  • 学会等名: ARVO India
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Mechanisms of transcriptional regulation by ARMS2/HTRA1 haplotype as risk factor for age-rerated macular degeneration (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Iwata
  • 学会等名: International Symposium on Retinal Degeneration 2018
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Molecular characteristic of macular suscepribility for dysfunction and degeneration (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Iwata
  • 学会等名: International Society for Eye Research 2018
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] ARMS2/HTRA1 as Potential Theraperutic Target for Age-related Macular Degeneration (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Iwata
  • 学会等名: International Society for Eye Research 2018
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 緑内障遺伝子解析から個別医療へ (2018)
  • 著者名/発表者名: 岩田岳
  • 学会等名: 第29回日本緑内障学会
  • 招待講演
• [学会発表] Global Eye Genetics Consortium (GEGC) (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Iwata
  • 学会等名: All India Ophthalmological Society Conference 2018
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] Global Eye Genetics Consortium (GEGC) (2018)
  • 著者名/発表者名: Takeshi Iwata
  • 学会等名: Asia-Pacific Academy of Ophthalmology Congress 2019
  • 国際学会 / 招待講演
• [学会発表] 座長：基礎研究から病態を捉える (2018)
  • 著者名/発表者名: 岩田岳
  • 学会等名: Retinal Research Forum 2018
  • 招待講演
• [図書] Advances in Vision Research Volume II, Essentials in Ophthalmology (2018)
  • 著者名/発表者名: Gyan Prakash and Takeshi Iwata (Eds)
  • 総ページ数: 468
  • 出版者: Springer Nature
  • ISBN: 978-981-13-0883-3
• [図書] 遺伝子医学 MOOK (2018)
  • 著者名/発表者名: 須賀晶子、吉武和敏、岩田岳（編集：松本直道、難波栄二、古川洋一）
  • 総ページ数: 216(うち38-47)
  • 出版者: オミックス解析による遺伝性網脈絡膜疾患の病因・病態機序の解明、臨床応用に向けた疾患シークエンス解析
  • ISBN: 978-4-944157-28-0
• [備考] Iwata Laboratory
  • URL: http://www.iwatalab.org/
• [備考] 独立行政法人国立病院機構東京医療センター 感覚器センター 分子細胞生物学研究部
  • URL: http://www.kankakuki.go.jp/lab_e.html
• [産業財産権] 加齢黄斑変性の診断マーカー、診断キット、診断補助方法、及び、発症リスク判定方法 (2018)
  • 発明者名: 岩田岳、野田徹、家島大輔
  • 権利者名: 岩田岳、野田徹、家島大輔
  • 産業財産権種類: 特許
  • 産業財産権番号: PCT/JP2017/044697