| 研究実績の概要 |
前年度では無細胞タンパク質合成系とセミインタクト細胞を組み合わせた新規システムを用いることで、新生鎖のジスルフィド結合形成過程の観察に成功している。本年度は基質の普遍性を調べるため、いくつかの基質を選定し、解析を行った。具体的には、in vitro酸化的フォールディングのモデル基質であるBovine Pancreatic Trypsin Inhibitor (BPTI)や、糖尿病に関わるInsulin、透析アミロイドーシスに関わるβ2-microglobulin (β2m)を選定した。新規システムを用いたSDS-PAGE解析の結果、BPTI, Insulin及びβ2m新生鎖のシグナルペプチドの切断や糖鎖付加反応が観察でき、それら新生鎖がセミインタクト細胞の小胞体内に挿入されることを確認した。次に、それら新生鎖のジスルフィド結合形成の有無をSDS-PAGE解析した結果、β2m新生鎖の全長が小胞体内腔に露出した時にジスルフィド結合形成することがわかった。しかしながら、BPTIやInsulinの両新生鎖のジスルフィド結合形成は観測されなかった。一方、BPTIやInsulin新生鎖はRNase Aによってリボソームから新生鎖を解離させると、ジスルフィド結合形成が観測された。これらの結果から、β2mの場合、小胞体内腔において翻訳伸長反応中にジスルフィド結合形成することが考えられるが、BPTIやInsulinの場合、翻訳伸長反応中ではなく、翻訳後にリボソームから解離することでジスルフィド結合が導入されることがわかった。
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