研究課題
本研究課題の目的は、細胞毒性活性を有するoxaleimide類の生合成における、ユニークな反応を触媒する酵素の機能解析である。特に末端二重結合およびイミド環の連続構築や、デカリン環の環縮小反応に注目し、これらの反応機構を明らかにすべく研究を行ってきた。本年度においては昨年度に続き、デカリン環からのインデン環への環縮小反応に関与する酵素の機能解明に着手した。Oxaleimide類生合成における環縮小反応に関しては、デカリン環の二重結合の酸化、および2位の3級炭素への水酸基の導入が必要であると考えられている。最初の酸化反応を触媒する酵素、PoxDの精製を昨年度と同様に行った。膜貫通型のシトクロームP450であるPoxDは、デカリン環の二重結合の酸化を触媒することが昨年度の研究結果から明らかとなったが、その反応機構は不明のままである。そこでPoxDの結晶構造を明らかにすることで、その反応機構の解明を目指した。タンパク質結晶化には高純度のタンパク質が必須であるため、PoxDの高純度精製を試みた。PoxDは膜貫通型のタンパク質であるため、まず膜貫通領域を欠失させ可溶化タンパク質獲得を試みた。しかしながら大腸菌を宿主として発現させたが、望む可溶化タンパク質は得られなかった。そこで膜貫通領域のN末端側を改変したところ、可溶性画分にPoxDが得られることが分かった。大腸菌膜画分を界面活性剤を含む可溶化バッファーに懸濁した後、Ni-NTAと結合させ精製を行った。続いて陽イオン交換、ゲルろ過カラムクロマトグラフィーに供し、高純度精製を行った。現在、得られたタンパク質を結晶化スクリーニングに供している。今後は精製タンパク質量を増やし、化合物添加の有無やスクリーニング条件にて結晶化条件を決定する予定である。
平成30年度が最終年度であるため、記入しない。
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ChemBioChem
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