|
現在の医薬品開発における酵素誘導試験は、ヒト肝細胞に被験物質を処置し薬物代謝酵素の発現量や酵素活性を測定する必要があり、ロット間差、高コスト、手技の煩雑さ等の問題点があることから、より安価で簡便な評価手法の開発は、スクリーニングの効率化に貢献できる。核内受容体CAR及びPXRは酵素誘導の原因タンパク質であるため、両受容体の活性化評価は酵素誘導試験を代替できると思われた。そこで申請者らは、両受容体の組換えタンパク質を用いて活性化評価系の構築を目指した。まず初めにCAR及びPXR全長タンパク質の調製を試み、SUMOタグ及び独自に調製した可溶化溶液を用いて両受容体の高純度精製に成功し、ゲルシフトアッセイあるいは蛍光偏光解消法によりリガンド依存的な結合DNA配列への結合を確認した。これら組換えタンパク質を用い、リガンド依存的な受容体の構造変化を検出することで、スループット性の高い活性化評価系の構築を試みた。転写共役因子の結合領域であるAF2領域のリガンド結合依存的な構造変化に伴う転写共役因子の結合を蛍光偏光解消法により調べたところ、両受容体はリガンド結合によってAF2領域が構造変化せず、リガンド依存的な活性化が認められない結果を得た。そこでAF2領域とその直前のヘリックス11の間にスペーサーを導入した変異体を作製した。その結果、リガンド依存的なAF2の構造変化が認められ、リガンドの結合を評価可能なアッセイ系の構築のためのCARおよびPXRタンパク質を得た。変異体を用いて、すでに報告されている数種類のリガンドによる受容体の活性化を調べたところ、感度良く活性化を検出できた。
|
