インフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染におけるエピジェネティック制御機構の解明

2017 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17H07090
• 研究機関: 慶應義塾大学
• 研究代表者: 八木 一馬 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (00594566)
• 研究期間 (年度): 2017-08-25 – 2019-03-31
• キーワード: インフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染 / エピジェネティクス

研究実績の概要

インフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染マウスモデルを作成し、8-12週齢Ezh2 cKOマウス及び対照マウスに対して、非致死量のインフルエンザウイルス(A/PR8; H1N1) 5 pfuを経鼻投与、7日後に肺炎球菌(血清型3型)1.0×10^4 cfuを経鼻投与した。Ezh2 cKO 群で対照群と比較し有意に生存率が低下することを繰り返し確認した。また、肺炎球菌感染 24 時間後の気管支肺胞洗浄(BAL)液総細胞数及びマクロファージ数がcKO 群で有意に上昇し、24時間後のBAL液中のIL-1βがcKO群で有意に上昇した。さらに、Flow cytomertyを用いて肺内免疫担当細胞の検討を行ったところ、肺炎球菌感染 18・36時間後の肺NK細胞が Ezh2 cKO群で有意に増加しており、インフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染におけるNK細胞の関与の可能性が考えられた。同感染モデルにおけるNK細胞の関与をさらに検討するため、肺炎球菌感染前にNK1.1中和抗体を投与してインフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染マウスの生存率を評価したところ、有意差は認めないもののNK1.1中和抗体投与群でEzh2 cKOマウスの生存率が改善傾向を示していた。Ezh2 cKO群の生存率低下の一因としてNK細胞の関与が考えられ、インフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染マウスモデルにおいて、Ezh2がNK細胞関連遺伝子群の発現調節に寄与している可能性が示唆された。

現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

Ezh2 cKOマウスを用いたインフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染マウス実験において、その標的細胞集団の一つとしてNK細胞が考えられたが、標的遺伝子の特定には至らなかった。そのため、各細胞の遺伝子発現解析をリアルタイムPCR法さらにはRNA-sequence法により網羅的に解析することまでできていない。

今後の研究の推進方策

<1> Ezh2 cKOマウス用いたインフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染実験
研究協力者である中山俊憲教授(千葉大学大学院医学研究院免疫発生学)より供与を受け、当研究室で既に飼育しているEzh2 cKOマウス及び対照マウスでインフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染マウスモデルを作成し、①生存率、②体重推移、③肺内肺炎球菌量(コロニー数)、④気管支肺胞洗浄液中の細胞数及び細胞分画、⑤気管支肺胞洗浄液及び血清中の各種サイトカイン発現量(ELISA法やリアルタイムPCR法)、⑥肺内免疫担当細胞分画及び表面マーカー発現(マウス肺を単細胞とし、各種細胞表面カーカー抗体で染色後にFlow cytometryで評価)、⑦肺病理組織、を両群で比較検討する。また、予備実験で有意差があったマクロファージやNK細胞、及び感染免疫に重要な好中球に着目し、Flow cytometryでソート後、⑧各細胞の遺伝子発現解析をリアルタイムPCR法さらにはRNA-sequence法により網羅的に解析し、Ezh2により影響を受ける遺伝子を同定し評価する。

<2> インフルエンザ感染後肺炎球菌2次感染におけるEzh2の標的遺伝子の探索
上記実験においてEzh2 cKO群で発現が上昇する遺伝子はEzh2の標的遺伝子と考えられるため、各標的候補遺伝子プロモーター領域におけるEzh2及びH3K27me3の発現をChIP assayで検討する。研究協力者である中山俊憲教授が最近報告している方法 (Tumes DJ, Nakayama T et al. Immunity. 2013)を参考にし、ChIP-sequence法によりEzh2が作用する標的遺伝子を網羅的に探索し、Ezh2の役割を解明する。

研究成果

• [雑誌論文] Clinical characteristics of pulmonary Mycobacterium lentiflavum disease in adult patients. (2018)
  • 著者名/発表者名: Yagi K, Morimoto K, Ishii M, Namkoong H, Okamori S, Asakura T, Suzuki S, Asami T, Uwamino Y, Funatsu Y, Fujiwara H, Kamata H, Nishimura T, Betsuyaku T, Kurashima A, Hasegawa N.
  • 雑誌名: Int J Infect Dis 巻: 67 ページ: 65
  • DOI: 10.1016/j.ijid.2017.12.001.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] The efficacy, safety, and feasibility of inhaled amikacin for the treatment of difficult-to-treat non-tuberculous mycobacterial lung diseases. (2017)
  • 著者名/発表者名: Yagi K, Ishii M, Namkoong H, Asami T, Iketani O, Asakura T, Suzuki S, Sugiura H, Yamada Y, Nishimura T, Fujiwara H, Funatsu Y, Uwamino Y, Kamo T, Tasaka S, Betsuyaku T, Hasegawa N.
  • 雑誌名: BMC Infect Dis. 巻: 17 ページ: 558
  • DOI: 10.1186/s12879-017-2665-5.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Impact of chronic Pseudomonas aeruginosa infection on health-related quality of life in Mycobacterium avium complex lung disease. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kamata H, Asakura T, Suzuki S, Namkoong H, Yagi K, Funatsu Y, Okamori S, Uno S, Uwamino Y, Fujiwara H, Nishimura T, Ishii M, Betsuyaku T, Hasegawa N.
  • 雑誌名: BMC Pulm Med 巻: 13 ページ: 198
  • DOI: 10.1186/s12890-017-0544-x.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [雑誌論文] Impact of cavity and infiltration on pulmonary function and health-related quality of life in pulmonary Mycobacterium avium complex disease: A 3-dimensional computed tomographic analysis. (2017)
  • 著者名/発表者名: Asakura T, Yamada Y, Namkoong H, Suzuki S, Niijima Y, Kamata H, Funatsu Y, Yagi K, Okamori S, Sugiura H, Ishii M, Jinzaki M, Betsuyaku T, Hasegawa N.
  • 雑誌名: Respir Med 巻: 126 ページ: 9
  • DOI: 10.1016/j.rmed.2017.03.010.
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] ヒストンメチル基転移酵素Ezh2はインフルエンザウイルス感染後肺炎球菌2次感染マウスに保護的に作用する．Histone methyltransferase Ezh2 protects mice against lethal post-influenza pneumococcal infection. (2017)
  • 著者名/発表者名: 八木一馬，石井誠，鎌田浩史, 平原潔，南宮湖，浅見貴弘，朝倉崇徳，鈴木翔二，岡森慧，加茂徹郎，中山俊憲, 長谷川直樹，別役智子.
  • 学会等名: 第57回日本呼吸器病学会学術講演会
• [学会発表] The efficacy, safety and feasibility of inhaled amikacin for the treatment of refractory non-tuberculous mycobacterial lung diseases. (2017)
  • 著者名/発表者名: Kazuma Yagi, Makoto Ishii, Ho Namkoong, Takahiro Asami, Osamu Iketani, Takanori Asakura, Shoji Suzuki, Satoshi Okamori, Hiroaki Sugiura, Yoshitake Yamada, Tomoyasu Nishimura, Hirofumi Kamata, Hiroshi Fujiwara, Yohei Funatsu, Yoshifumi Uwamino, Tomoko Betsuyaku, Naoki Hasegawa.
  • 学会等名: ERS International Congress 2017
  • 国際学会