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本研究では哺乳類精子のエピゲノム情報が精子核凝集に伴うヒストンの排斥によってプログラムされているという概念を提唱するため、ヒストン排斥前の精子細胞、すなわち円形精子細胞に由来する胚が低発生率である事実に立脚し、それに関る遺伝子群を探索する。このために円形精子細胞を用いて顕微受精させ (ROSI)、そこから得られた胚 (ROSI胚) を用いて網羅的な遺伝子発現解析を行うが、本年度はその実験のセットアップに注力した。まず顕微授精の後、前核期においてDNAのメチル化レベルが正常と異常な胚に分類するが、このためのライブイメージング条件を検討した。具体的にイメージングプローブとして、メチル化DNA結合ドメイン (MBD) に蛍光タンパク質を付加した融合タンパク質 (MBDプローブ)を用いるが、細胞毒性を与えず、かつイメージング可能な最適濃度を決定し、更に顕微鏡や庫内環境の設定を最適化した。次に少数細胞によるRNA-seq解析を行うために、RNAを線形的に増幅させる系が必要となるが、そのセットアップも行った。ここで決定した条件を用いて、今後は正常胚と異常なROSI胚の遺伝子発現変化をRNA-seq解析で網羅的に検証する予定である。
一方で、ROSI胚の低発生を惹起するエピゲノム修飾に関して候補を得ることができたので、その可能性を検討した。まず、着目したヒストン修飾が正常胚と比較して、ROSI胚においてのみ前核期で異常な動態を示すことがわかった。更にこれが脱修飾酵素を過剰発現させることで改善できることを確認できた。現在はこの方法によってROSI胚の低発生効率が改善されるか検討中である。
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