| 研究課題/領域番号 |
17J00067
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| 研究機関 | 兵庫県立大学 |
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研究代表者 |
小森 亮太 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| キーワード | ゴルジ体 / プロテオグリカン / 細胞小器官 / ストレス応答 |
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| 研究実績の概要 |
細胞内に存在する細胞小器官の量は、細胞の需要に応じて厳密に制御されている。このような細胞小器官の量的調節機構は細胞が自律的に機能するために必須の機構であり、細胞生物学の根本的命題の一つである。ゴルジ体ストレス応答とは細胞小器官であるゴルジ体の量的調節機構である。本研究はゴルジ体ストレス応答のプロテオグリカン経路の分子機構を明らかにすることを目的としており、本年度は、転写制御配列の同定、転写制御因子の同定を中心に研究を行った。
転写制御配列の同定については、ルシフェラーゼを利用したレポーターアッセイを行った。まず、ゴルジ体ストレス応答のプロテオグリカン経路の活性化により転写調節される遺伝子の一つであるHS6ST1のプロモーター領域を解析し、プロテオグリカン経路を活性化する配列を得た。そして、その結果から得られた配列を4回繰り返してレポーターアッセイを行ったところ、ゴルジ体ストレスによる転写活性が飛躍的に上昇した。また、HS6ST1のプロモーター領域からこの配列を削除した配列を用いてレポーターアッセイを行ったところ、ゴルジ体ストレスによる転写活性がほとんどなくなった。さらに、プロテオグリカン経路の活性化により転写調節される他の遺伝子にも同様の配列が存在することがわかった。これらの結果より、プロテオグリカン経路を活性化する転写制御配列を明らかにし、その配列をPGSEと名付けた。
転写制御因子については、酵母を用いたyeast-one-hybrid法により同定を試みたが、有力な転写制御因子の候補を得ることはできなかった。このことは、おそらく目的の転写制御因子が複数の遺伝子によりコードされているために、yeast-one-hybrid法では単離できないことを示唆していると考えられる。今後は、CRISPR-Cas9を利用したGeCKOライブラリーを用いて転写制御因子を同定する計画である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究は、ゴルジ体ストレス応答のプロテオグリカン経路の分子機構を明らかにすることを目標としている。本年度は、転写制御因子の同定までは到らなかったが、転写制御配列PGSEを同定することができた。転写制御配列PGSEが明らかになったことは、転写制御因子やセンサー分子の同定など、プロテオグリカン経路の分子機構を明らかにする上で大きな足がかりになる。また、転写制御配列の研究成果について論文を執筆中であることから、上記の評価をした。
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| 今後の研究の推進方策 |
今後は、ゴルジ体ストレス応答のプロテオグリカン経路における転写制御因子、センサー分子の同定を行う計画である。酵母を用いたyeast-one-hybrid法では、転写制御因子の同定を行うことができなかった。そこで、今後はCRISPR-Cas9を利用したGeCKOライブラリーを用いて転写制御因子を同定する計画である。yeast-one-hybrid法では、複数の種類の転写制御因子が転写制御配列PGSEに結合する場合、その単離が困難であった。しかし、GeCKOライブラリーを用いた方法では、この問題が解決できる。さらに、この方法は転写制御因子だけでなく、センサー分子の同定も同時に行うことができる方法であるため、これらを並行して進めていく。
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