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本年度は、前年度までに明らかにしたタイトジャンクション領域に多く存在するコレステロールや炭素数２０以上の極長鎖脂肪酸鎖を有するスフィンゴミエリンがタイトジャンクションの形成にどのように関与しているかを調べた。そこで、タイトジャンクションを消失した細胞における脂質の局在や脂質組成を調べることで、タイトジャンクション領域の脂質がClaudinを集積させ、タイトジャンクションの形成に至っているのか、または、脂質の集積がClaudinを集積させ、タイトジャンクションの形成を誘導しているのか、手がかりを得ようと考えた。タイトジャンクションは複数のClaudinアイソフォームが集積して形成されている。そのため、一つのClaudinアイソフォームを欠損しても、タイトジャンクションの構造は維持されたままである。そこで、すべてのClaudinアイソフォームを欠損した上皮細胞株を樹立することにした。CRISPR-Cas9法を用いた遺伝子編集によって、すべてのClaudinを欠損したClaudin null細胞の樹立に成功している。現在、Claudin null細胞での細胞膜脂質の局在や脂質組成の変化を解析中である。
また、前年度までに行っていたアドヘレンスジャンクションの必須構成タンパク質であるα-cateninを欠損したα-catenin KO細胞を利用したタイトジャンクション形成機構の解析に関しても、新たな知見を得ることができた。タイトジャンクションの形成には、アドヘレンスジャンクションの形成が先立って必要である。これまでに、アドヘレンスジャンクションの形成による細胞膜脂質の局在の変化がタイトジャンクションの形成を誘導することを報告してきたが、細胞骨格の配向性等の変化もタイトジャンクションの形成に必要であるという予備的なデータを得つつあるので、その点に関しても検討を進めていきたい。
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