| 研究課題/領域番号 |
17J00694
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| 研究機関 | 京都大学 |
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研究代表者 |
浜島 りな 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| キーワード | リボソーム / NRD / 機能不全変異rRNA / 出芽酵母 |
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| 研究実績の概要 |
本研究課題は、25S rRNAに変異を持つリボソームの分解機構25S NRDに着目した解析を行うことで、真核生物におけるリボソームの分解経路とその制御機構を明らかにすることを目的としている。本年度は、分解中間体の精製法の条件検討を行い、精製条件を決定した (1)。そして、決定した条件で精製した機能不全リボソーム分解中間体について、分解の標的となるタンパク質 (鍵因子) の候補をSDS-PAGEと銀染色により見出した。そこで、鍵因子候補タンパク質を含むゲルバンドから抽出したペプチド、また、精製した機能不全リボソーム分解中間体について、LC-MS/MS解析により、鍵因子の同定を試みた (2)。
(1) 機能不全リボソーム分解中間体の精製法の確立
昨年度に引き続き、機能不全リボソーム分解中間体の精製法の確立に取り組んだ。プラスミド由来rRNAを持つリボソームを回収するためのMS2コートタンパク質とアビジン-ビオチン相互作用を利用したプルダウンアッセイの際に用いるストレプトアビジンビーズについて検討を行った結果、磁性ビーズを用いることでバックグラウンドが減少することが明らかとなった。
(2) LC-MS/MS解析による鍵因子の探索 (首都大学 田岡准教授との共同研究)
(1) を用いて二つの異なる株から精製した機能不全リボソーム分解中間体について、SDS-PAGEによる分離、銀染色のバンドパターンの比較により、鍵因子の候補となるタンパク質のバンドを見出した。これらの候補タンパク質を含むと考えられるバンドと、精製した機能不全リボソーム分解中間体について、LC-MS/MS解析を行った。その結果、検出された大部分がリボソームタンパク質であったが、バックグラウンドが高かったため、鍵因子の候補について、はっきりとした結論は得られなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
3: やや遅れている
理由
今年度は、昨年度に引き続き、機能不全リボソーム分解中間体の精製法の確立に取り組んだ。精製条件の検討の結果、バックグラウンドが以前よりも少なくなる条件を見出した。次に、精製されたタンパク質分解を受ける前後の機能不全リボソーム分解中間体について、銀染色により構成タンパク質のバンドパターンの比較を行った。その結果、いくつかのタンパク質が分解の標的となる可能性が示された。さらに、機能不全リボソーム分解中間体において分解の標的となるタンパク質を明らかにするために、銀染色で分解の標的となる可能性が示されたタンパク質を含むゲルと、精製した機能不全リボソーム分解中間体について、LC-MS//MS解析を首都大学の田岡准教授との共同研究として行った。しかし、今回の解析ではバックグラウンドの値が高く、分解の標的となるタンパク質についてはっきりとした結論は得られなかった。このことから、当初の予定よりも精製条件のさらなる検討を行う必要性が生じたため。
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| 今後の研究の推進方策 |
機能不全リボソームの精製法について、プルダウンに用いる磁性ビーズの種類や量、ブロッキングの方法など、あらゆる条件検討を行う。バックグラウンドの低下が認められれば、昨年度と同様にLC-MS/MSを用いた解析を行い、機能不全リボソームの分解の指標となるタンパク質を決定する。
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