| 研究課題/領域番号 |
17J01066
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
阿出川 さとみ 東京農工大学, 大学院生物システム応用科学府, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| キーワード | Bacillus thuringiensis / Bt毒素 / Cry毒素 / ABCトランスポーター / タンパク質工学 |
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| 研究実績の概要 |
今年度は4つの課題を並行して研究を進めた。①Bt毒素新規受容体探索系の改良：昨年度構築した探索系が有効かどうかを調べるために、LC-MS/MSを用いて解析したところ、リポカリンなどのCry1Aa毒素に結合することが既知のタンパク質が検出されたが、期待していたABCトランスポーターC2（ABCC2）は検出されなかった。②Sf9細胞上のCry1Ca受容体候補の推定：Spodoptera frugiperdaの卵巣由来の培養細胞であるSf9細胞はBt毒素の一種であるCry1Caに感受性を示す。そこでCry1Caの受容体同定を目指し、Sf9細胞上に発現するABCトランスポーターfamily分子の配列をPCソフトを利用して解析したところ、18個のSfABCトランスポーター配列が予測できた。③ABCトランスポーターとの結合に重要なBt毒素上のアミノ酸残基の解析：ABCトランスポーターとの結合に重要なアミノ酸残基が存在するBt毒素上の領域を異なるBt毒素間ですげかえた変異体を構築したが、毒素の活性化に必要なトリプシン処理に対する耐性を失っており、続く実験に用いることができなかった。現在、別の手法による変異体の構築を急いでいる。④タンパク質工学実施のためのファージパニング手法の改良：本研究で用いるABCトランスポーターにはC末端にFLAGタグが融合される。そこで抗FLAG抗体を提示するプレートやビーズを担体として用いることにし、ABCトランスポーターの安定的可溶化条件や、担体への固定化条件、ファージの担体への非特異的結合を防ぐ方法などを求め、試行錯誤を重ねた。その結果、抗FLAG抗体提示磁気ビーズを用い、UV照射によりDNAを破壊し増殖できないようにしたファージ（UVファージ）をブロッキング剤として高濃度で用いることでファージパニングが可能であることが明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の主軸のひとつであるBt新規受容体探索系が予想以上に難航しているが、クリアすべき課題がより具体的に見えてきている。また、本研究の最終目標であるタンパク質工学のためのファージパニング手法の改良を無事に終えた。ゆえに総合的に見れば、研究はおおむね順調に進展していると言えるだろう。各課題の詳細な進捗状況を以下に述べる。
①Bt毒素新規受容体探索系の改良：抗ABCC2抗体を用いたウエスタンブロッティングでは検出できていることから、LC-MS/MSで検出するにはABCC2の絶対量が足りなかった、もしくはリポカリンなどの多量のタンパク質にマスクされ検出できなかった (相対量が足りない) のではないかと考えられた。②Sf9細胞上のCry1Ca受容体候補の推定：現在HEK293T細胞での異所発現システムを使用して、予測配列が得られたこれらのSfABCトランスポーターがCry1Caの機能的受容体として作用できるかどうかを分析している。③ABCトランスポーターとの結合に重要なBt毒素上のアミノ酸残基の解析：現在、別の手法による変異体の構築を急いでいる。具体的にが活性化状態で組換え大腸菌に毒素を産生させる方法、活性化しない前駆体状態の毒素のまま結合親和性解析に用いる方法、受容体結合に関連するドメインIIの部分のみ発現させる方法を考えた。このうち、活性化しない前駆体状態の毒素のままでは結合親和性解析することが難しいことが明らかとなった。現在残る２つの方法を実施するべく準備を急いでいる。④タンパク質工学実施のためのファージパニング手法の改良：UVファージの高濃度濃縮に手間がかかるのが難点だが、ファージ選抜時に非特異的結合を抑えるのに重要な要因であることが明らかになったため、調整を怠らないように注意している。
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| 今後の研究の推進方策 |
新規受容体探索系の構築が予想以上に困難であり、最終年度までもつれ込んでいる。ゆえに探索系に関しては当初の予定を変更し、受容体既知のCry1Aa毒素の受容体（特にABCトランスポーターfamily分子）がLC-MS/MSで検出てできるような、モデル実験系の構築を目指す。具体的には、Cry1Aaの受容体であるカイコガのABCC2がLC-MS/MSで検出できるように濃縮し、毒素と結合能をもつだけの非受容体タンパク質と分けるための方法を決定し、モでル実験系の構築を急ぐ。一方で、新規受容体の推定法として昨年度実施していた、昆虫培養細胞Sf9細胞上のABCトランスポーターfamily分子の推定とクローニングが順調に進んでいる。Cry1Caの受容体となりうるかどうかをHEK293T細胞による異所発現系で急ぎ解析し、論文としてまとめ発表する。昨年度までの結果から毒素のループ根元の部位にABCトランスポーターとの結合に重要なアミノ酸が存在していることが示唆されている。毒素間でもそれが共通しているか、毒素間でループ根元領域をすげ替えた変異体作製を急ぎ、結果をまとめ、論文として発表する。また、Sf9細胞はCry1Caには感受性だがCry1Aaには非感受性である。また、本研究の主軸のもうひとつである、Bt毒素の人為的改変を実際に実施する。
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