| 研究課題/領域番号 |
17J01654
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
井上 望 大阪大学, 工学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| キーワード | タンパク質修飾 / N末端選択的修飾 / ヘムタンパク質 / タンパク質固定化 / クリックケミストリー |
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| 研究実績の概要 |
バイオ燃料電池はエネルギー分野や農業分野あるいは医療分野への応用が期待されるバイオデバイスである。とくに金属タンパク質の酸化還元反応を用いたバイオ燃料電池の高性能化において、より高い電極特性を達成するためには、タンパク質と電極材料間の効率的電子移動の実現が強く求められる。そこで、活性中心となる補因子の配向性を制御し、金属タンパク質を電極上に多点で固定化した系を構築するために、合成化学的アプローチと生化学的アプローチを統合した金属タンパク質－電極材料複合化手法の確立をめざした。当該年度は活性中心に補因子ヘムを有する電子伝達タンパク質シトクロムb562をモデルタンパク質に選定し、アジド基を有するヘムをアポシトクロムb562に挿入することで、アジド基を有するシトクロムb562を調製した。一方で電気化学的還元法によりアルキン基を修飾した炭素電極を作成し、銅を触媒とするアルキン－アジド環化付加反応（CuAAC反応）を介して、活性中心のヘム分子を直接固定化したシトクロムb562－炭素電極複合材料の構築を達成した。
合わせて、タンパク質N末端選択的にアジド基を導入可能な修飾剤の開発にも取り組んだ。本研究では、タンパク質に普遍的に存在し、機能への影響が小さいと考えられるN末端アミノ基をターゲットに選択した。N末端アミノ基に選択的に作用し、イミダゾリジノン環を形成することが知られているピリジンカルボアルデヒドを母骨格とする種々のアジド基導入剤を合成し、モデルペプチド・タンパク質との反応を行った。加えて、導入されたアジド基を起点としてCuAAC反応を介したN末端選択的な機能性分子導入についても実施した。補因子およびN末端にアジド基を導入したシトクロムb562の二点固定化について現在検討中である。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
アルキン基を電気化学的還元法により修飾した炭素電極とアジド基を補因子ヘムに直接導入したシトクロムb562を用いて、活性中心ヘムを電極に直接固定化し、タンパク質配向性が高度に制御されたヘムタンパク質－電極複合材料の構築を達成した。また、多点固定化に向けてタンパク質マトリクスにアジド基を導入する手法の開発にも取り組んだ。修飾法の普遍性と機能への影響低減の観点から、タンパク質N末端アミノ基をターゲットに選択し、2-ピリジンカルボアルデヒドを母骨格とする種々のアジド基導入剤を合成し、質量分析法を用いた反応評価を行った。種々のタンパク質基質へのN末端アジド基導入では温和な条件下～90%と良好な修飾率が得られた。また、導入したアジド基を起点とするCuAAC反応を介した機能性分子導入を実施し、ビオチン・蛍光色素・ポリマー材料のN末端選択的な導入を～90%の収率で達成した。現在、当初の計画どおりアジド基が補因子ヘムおよびN末端に導入されたシトクロムb562の調製とCuAAC反応を介した電極基板上への二点固定化について検討を進めている。
以上のように、本研究課題の実施によって酸化還元活性なヘムタンパク質の電極材料表面への配向性を制御した固定化と、タンパク質N末端選択的なアジド基導入が可能となった。これらの研究成果をもとに、国際学会での発表や特許申請・学術論文の作成を進めており、本研究課題はおおむね順調に進展したと判断した。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究課題の実施によって、効率的な電子伝達を実現する炭素電極材料と酸化還元活性なヘムタンパク質を複合化したバイオハイブリッド電極の構築に成功した。またN末端選択的なアジド基導入剤の開発も達成している。今後は以上の二つの技術を統合し、ヘムタンパク質を電極表面に多点で固定化することで、空間配置に加えて動的挙動が精密に制御されたバイオハイブリッド電極の構築をめざす。具体的には、アジド基が補因子ヘムおよびN末端に導入されたシトクロムb562の調製とCuAAC反応を介した電極基板上への二点固定化を行い、得られたヘムタンパク質多点固定化電極のサイクリックボルタンメトリー測定・インピーダンス測定など電気化学測定からタンパク質の固定化量・電子伝達効率などの電極特性を評価する。また一点で固定化した系との電気化学的特性の違いについても検討する。さらに、タンパク質固定化構造を原子間力顕微鏡（AFM）、紫外可視・赤外分光法など分光学的手法からも評価が可能である。得られた知見を基に、シトクロムb562修飾に用いるリンカー分子の構造を検討することで、精密な固定化構造構築に向けた最適化が期待できる。
以上のように、二点固定化電極の作成と評価系の構築に加えて、構造最適化が今後の推進方策として挙げられる。
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