2017 年度実績報告書

三倍体ドジョウの配偶子形成過程における特殊な染色体挙動と妊性に関する研究

研究課題

研究課題/領域番号	17J01971
研究機関	北海道大学
研究代表者	黒田真道北海道大学, 水産科学院, 特別研究員(DC1)
研究期間 (年度)	2017-04-26 – 2020-03-31
キーワード	FISH / 染色体識別プローブの開発 / 自然クローンの交雑起源
研究実績の概要	ドジョウ Misgurnus anguillicaudatus には遺伝的に分岐したA、Bの二系統が存在する。また、一部地域には遺伝的に同一で雌性発生を行うクローン二倍体が生息し、このクローンはA系統とB系統の交雑起源であることが推測されている。また稀に精子核を取り込む場合がありクローン由来の三倍体が作られる。本年度は①様々なゲノム組成を持つ供試魚の作出、②A系統の染色体識別プローブの開発を行った。それぞれの研究実施状況を以下に記す。 ①第二極体放出阻止による同質・異質三倍体とクローン由来三倍体の作出を行った。 ②A系統個体からゲノムDNAを抽出後、29種類の制限酵素を用いてDNA断片化、そして電気泳動によりサテライトDNAの有無を確認した。その結果、制限酵素DraⅠを用いて切断することによりサテライトDNA(136bp)が得られ、このサテライトDNAが挿入されたプラスミドを新規プローブとしてFISHを行った結果、B系統の染色体ではシグナルが検出されなかったのに対して、A系統では多数の端部動原体着糸型 (T型) 染色体のセントロメア領域にシグナルが検出された。また系統間雑種では、B系統由来の染色体を特異的に検出するManDraプローブと新規プローブを用いてFISHを行った結果、A系統由来の多数のT型染色体でシグナルが検出された。さらにクローン個体に対して、FISHを行った結果、半数の染色体でManDraシグナルが検出され、残りの染色体の多数のT型染色体で新規プローブのシグナルが検出された。従って今回開発した新規プローブはA系統由来の染色体が識別可能で、クローンドジョウがA系統とB系統の交雑起源であることが分子細胞遺伝的にも強く示唆された。ドジョウにおいて、二系統の染色体を識別するプローブが存在することになった。これらは減数分裂中の染色体挙動を追跡する強力なツールとなる。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由平成29年度は①平成30、31年度の研究に利用する供試魚の作出と②A系統の染色体識別プローブの開発を目指した。それぞれの進捗状況を記す。 ①第二極体放出阻止による同質・異質三倍体、とクローン由来三倍体の作出の成功した。 ②これまでにドジョウのB系統の染色体を識別するManDraプローブは開発されているがA系統を識別するプローブは開発されていなかった。A系統のゲノムDNAを制限酵素DraⅠを用いて切断することによりサテライトDNAが得られた。このサテライトDNAが挿入されたプラスミドを新規プローブとしてFISHを行った結果、B系統の染色体ではシグナルが検出されなかったのに対して、A系統では多数の端部動原体着糸型 (T型) 染色体のセントロメア領域にシグナルが検出された。従ってこの新規プローブはA系統の一部の染色体識別が可能であると考えられた。ドジョウにおいて、二系統の染色体を識別するプローブが存在することになった。これらは様々なゲノム組成を持ち、特殊な減数分裂を行うドジョウにおける減数分裂中の染色体挙動を追跡する強力なツールとなる。
今後の研究の推進方策	平成29年度には、①平成30、31年度の研究に利用する供試魚の作出と②A系統の染色体識別プローブの開発に成功した。今後、作出した同質三倍体雄 (AAA,BBB) と異質三倍体雄 (AAB,ABB)、そして雄は不妊であるが雌では異質ゲノム排除により妊性を持つクローン由来三倍体雌 (AAB,ABB) の配偶子形成過程における染色体の挙動に注目して、雌雄やゲノム構成によってプロセスの異なる、不妊機構と不妊回避機構を解明を目指す。具体的には、同質三倍体雄 (AAA,BBB) においてシグナル数から倍数性が決定可能な5.8S＋28S プローブを用いてFISH を行い減数分裂時の相同染色体間での対合の挙動を観察し不妊の原因を調査する。さらに、異質三倍体雄 (AAB,ABB)の精巣からA 型精原細胞、B 型精原細胞、精細胞、精子様細胞を単離し、それぞれの細胞で5.8S＋28S プローブを用いてFISH を行い、シグナルの数から6n 細胞化のタイミングを解明する。またA 型精原細胞を培養し経時的に観察することで6n 細胞の形成メカニズムを解明する。次にクローン由来三倍体雌 (AAB,ABB) の卵巣から卵細胞を摘出し、動物極側に移動を開始した卵核胞を取り出してA、B 系統識別プローブを用いて2-Color FISHを行い、排除されたゲノムと1n 卵のゲノムを明らかにする。そして卵核胞移動が起こる以前の卵を成長段階ごとに単離し同様に2-Color FISH を行い、異質ゲノムの排除の方法とタイミングを明らかにして不妊回避機構の解明を目指す。