| 研究課題/領域番号 |
17J01971
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
黒田 真道 北海道大学, 水産科学院, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| キーワード | FISH / 染色体識別プローブの開発 / 自然クローンの交雑起源 / 特殊な配偶子形成 |
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| 研究実績の概要 |
日本に生息するドジョウにはA,Bの二系統が存在し、一部地域では二系統の交雑起源であるクローン系統が発見され、2n卵を作り雌性発生を行う。またクローン系統の二倍体が偶発的に精子を取り込むとクローン由来三倍体が生じる。この三倍体オスは様々な倍数性の受精能力を持たない精子を作り不妊になるが、メスは卵形成過程で異質なゲノムを１セット排除することで1nの卵を形成する。つまりメスには不妊を回避する機構が備わっており、また減数分裂のプロセスはゲノム構成・倍数性・雌雄によって異なることを示唆している。本研究では特にクローン由来三倍体メスが行う減数分裂プロセスの解明を目指している。そのためには二系統の染色体を識別するツールの開発が必要であり、これまでにB系統の染色体を識別するプローブ（ManDra-B）が開発された。それに対してA系統を識別するプローブ（ManDra-A）も開発されたが、シグナルが弱く安定した検出が困難であるといった問題があった。そこで安定してA系統の染色体を識別できるプローブを開発するため、既知のManDra-A配列 (136bp) を参考にManDra-A領域を増幅するプライマーを設計し、ManDra-A領域が5回繰返し存在すると推測された増幅産物からプローブ (ManDra-A 5 repeats) を作製しFISHを行った。その結果、A系統では2本の中部動原体着糸型 (M型) と24本の端部動原体着糸型 (T型) 染色体のセントロメア領域にManDra-A 5 repeatsシグナルが非常に安定して検出された。それに対してB系統ではシグナルが検出されなかったため、ManDra-A 5 repeatsプローブはA系統の染色体を識別する強力なツールになると判明した。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
特殊な配偶子形成を染色体の挙動から解明するには、各系統の染色体を識別するプローブが必要である。本年度の成果としてA系統の染色体を安定して検出するプローブの開発に成功した。これによって二系統の染色体挙動を追跡することが可能になった。また、サンプル魚も順調に成長しており、組織学的観察の材料として利用可能になっている。
また本研究の対象となる三倍体のオスはゲノム構成や倍数性によって形成する精子の倍数性やゲノム構成も変化することが報告されている。これまで精子のゲノム構成・倍数性は受精卵から生じた子孫のDNA解析とフローサイトメトリーの結果を組み合わせることで判定してきた。しかし、フローサイトメトリーでは個々の精子の倍数性を判別することはできず、受精能力を持たない異常精子のゲノム構成は子孫から推定できない。そのため個体のゲノム構成・倍数性が精子形成に与える影響を理解することが困難であった。そこで個々の精子のゲノム構成と倍数性を判別するためにA系統を識別するManDra-Aプローブ、B系統を識別するManDra-Bプローブ、そして倍数性を判定する5.8S＋28S rDNAプローブを用いてSperm-FISHによるゲノム構成と倍数性判別法の確立を目指してきた。これまでに系統判別プローブと倍数性判別プローブを組み合わせることで精子のゲノム構成と倍数性の判定が可能であることがわかってきた。今後さらに詳細に分析を行う。
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| 今後の研究の推進方策 |
クローン由来三倍体メスの卵巣を裁断後、最終成熟に関わるホルモンを用いて培養を行い、 (動物極側へ移動開始～崩壊) までの卵核胞を摘出し固定する。卵核胞に対してA、B系統識別プローブを用いて2-Color FISHを行い、1n卵ゲノムと排除ゲノムを調査する。またパーコールを用いて卵巣から各成長段階の卵母細胞を単離し、各卵母細胞でA、B系統識別プローブを用いて2-Color FISHを行い、異質ゲノムの排除機構を解明する。
同質三倍体オスの精巣から染色体標本を作製し5.8S＋28S rDNAプローブを用いてFISHを行い、精母細胞の減数分裂時における対合像を観察することで不妊原因を調査する。異質三倍体オスではパーコールを用いた不連続密度勾配遠心により、精巣細胞からA型精原細胞、B型精原細胞、精細胞、6n精子様細胞を単離し、各細胞で5.8S＋28S rDNAプローブを用いてFISHを行い、6n細胞化のタイミングを解明し、さらにA型精原細胞を培養し経時的に観察することで6n細胞の形成メカニズムを解明する。
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