| 研究課題/領域番号 |
17J02645
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
遠藤 充 北海道大学, 水産科学院, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| キーワード | 異種間雄性発生 / 核－細胞質相互作用 / ミトコンドリアDNA / ヘテロプラスミー / 種判別 / RFLP-PCR / ゼブラフィッシュ / コイ目魚類 |
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| 研究実績の概要 |
不妊化技術は、高成長個体や借腹生産の宿主個体作出の手段になることから、水産増養殖において有用である。従来、魚類の不妊化は、異種間交雑やゲノムの三倍体化など、核ゲノム同士の親和性に焦点をあてた方法で誘起されてきた。本研究では、植物や哺乳類において解明が進んでいる細胞質不妊機構に着想を得て、魚類において核と細胞質の不適合性に着目した新たな不妊化モデルの構築を目指す。本研究では、コイ目魚類であるゼブラフィッシュ、パールダニオ、キンギョ、ドジョウを供試魚に用い、核細胞質雑種（A種の核とB種の細胞質で構成）とヘテロプラスミック個体（A種の細胞内にB種のミトコンドリアが混在）を誘起して、異種由来細胞質および異種由来ミトコンドリアが配偶子形成に及ぼす影響を調査する。本年度は、核細胞質雑種とヘテロプラスミック個体の生残個体誘起に向けた研究と、ミトコンドリアDNAに対する種判別方法の検討を行った。
1. 核細胞質雑種：異種間雄性発生法により、パールダニオ二倍性核－ゼブラフィッシュ細胞質雑種を誘起した。孵化期まで生残したが、正常個体は得られず、生残率も極めて低かった。
2. ミトコンドリアDNAの種判別：種間のミトコンドリアDNAを遺伝学的に判別するため、ミトコンドリア遺伝子領域に種判別プライマーを設計し、ヘテロプラスミック個体の誘起の成否の確認が可能となった。また、ミトコンドリアDNA調節領域に対するRFLP-PCR法を用いた種判別も可能であることを確認した。
3. ヘテロプラスミック個体の誘起：未受精卵からのミトコンドリア単離方法の検討と並行して、異種精子の顕微注入によって誘起する方法を試みた。
本年度の研究成果の一部は、国内外の学会にて口頭発表し、核細胞質雑種誘起に必要なゼブラフィッシュの雄性発生技術は国際学術論文として受理された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
1. ゼブラフィッシュ雄性発生二倍体作出に用いる方法を応用し、異種間雄性発生法により、パールダニオ二倍性核－ゼブラフィッシュ細胞質雑種を誘起した。倍数性解析の結果、核細胞質雑種二倍体は受精卵数に対し、3.9 - 8.4 %の割合で誘起できた。しかし受精48時間後（孵化期）における生残率は8.5±2.1%であり、浮上、摂餌を開始する正常個体は得られなかった。生残率はゼブラフィッシュ通常受精群の88.8±1.4 %、パールダニオ半数性核－ゼブラフィッシュ細胞質雑種群の42.7±14.6 %と比較し、大幅に低下した。
2. 種判別プライマーとRFLP-PCR法を用いて、種間のミトコンドリアを遺伝学的に判別する方法を確立した。また、ゼブラフィッシュミトコンドリアDNA調節領域のRFLP-PCRにより、異なる塩基配列を持つ個体を確認した。その個体から子孫を作出し、配偶子を利用する準備が整ったため、同種間でのヘテロプラスミック個体の誘導を次年度以降の計画に追加する。
3. ヘテロプラスミック個体誘起に向け、未受精卵からのミトコンドリア単離方法の検討を行った。未受精卵を遠心分離した後、MitoTrackerの蛍光シグナルの局在から、ミトコンドリアを多く含む分画を判別し、効率的に単離する方法を検討中である。また、精子に含まれるミトコンドリアに着目し、精子の顕微注入によるヘテロプラスミック個体の誘起を試みた。ゼブラフィッシュとキンギョの異種間交雑ではヘテロプラスミック個体は誘起されなかった。しかしゼブラフィッシュ通常受精胚に対して、キンギョ精子を大量に顕微注入することにより、胚発生過程でキンギョ由来ミトコンドリアが検出された。胚発生の一部がヘテロプラスミーの状態で進行し、ヘテロプラスミック個体誘起方法の一つとなる可能性が考えられた。
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| 今後の研究の推進方策 |
1. 核細胞質雑種：雄性発生法によって誘起した核細胞質雑種半数体に倍加処理を加え、二倍性の核細胞質雑種を作出したが、生存個体は得られなかった。核細胞質雑種由来の配偶子形成過程を観察するため、生殖系列キメラの作出を引き続き行う。
2. ヘテロプラスミック個体：未受精卵からのミトコンドリア単離方法を確立し、ミトコンドリア移植による生存性ヘテロプラスミック個体の誘起を目指す。また、本年度に設計が完了したミトコンドリア遺伝子に対する種判別プライマーを用いて、ヘテロプラスミック個体中のドナー由来ミトコンドリアの定量を試みる。
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