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本研究は、X染色体不活性化現象に寄与する因子として、長鎖散在反復配列(LINE)に注目している。本年度は、①人工染色体を用いたX染色体不活性化におけるLINE機能の解析および、②人工染色体上に集積するXist RNAを中心とした染色体不活性化因子群の網羅的回収技術である染色体免疫沈降(ChrIP)法の樹立を目指した。
①LINEがX染色体不活性化に寄与するか示すため、LINEを持たない人工染色体にXist遺伝子を搭載した不活性化モデルを作製し、以降の解析を行った。FISH解析の結果、発現誘導されたXist RNAが人工染色体に自己集積していることが明らかになった。次に、人工染色体上に搭載されているモニター遺伝子のmRNAの転写量(qRT-PCR)とヒストン修飾の変化(ChIP-qPCR)を検証したところ、発現抑制されていることを示唆する結果を得た。以上の実験結果から、完全長のLINEが必ずしもXist RNAによる染色体不活性化に必要ではないことが示唆されたため、これらの結果を論文としてまとめ、ジャーナルへ投稿・掲載された。
②免疫沈降に用いるCRISPR/Cas9システムをプラスミドから組み換えタンパク質と合成gRNAの組み合わせに変更したため、これらの資材がin vitro実験法でも利用できるか検証した。まず、蛍光によって追跡可能な合成gRNAを用い、作製したgRNA依存的にマウス染色体上のmouse major satelliteに特異的に結合するか検討を行った。作製したgRNAを組み換えdCas9タンパク質と組み合わせ複合体を形成させマウスA9細胞に導入したところ、核内で特異的に集積している像を得た。これらの結果から、合成gRNAと組み換えdCas9タンパク質はChrIP法へ応用可能であることが示された。
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