| 研究課題/領域番号 |
17J05805
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
郷 詩織 名古屋大学, 生命農学研究科, 特別研究員(DC2)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| キーワード | GM3 / セラミド / シアル酸 / Neu5Gc / CerS6 |
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| 研究実績の概要 |
本研究は、筋分化に伴う細胞膜上に発現するガングリオシドのシアル酸分子種とセラミドアシル鎖分子種の変化の分子機構の解明と、その変化の結果形成される多様な分子種の役割の解明を大きな目的として行っている。筋細胞研究は筋ジストロフィーをはじめとする多くの筋疾患に関する研究が盛んである一方で、筋分化制御メカニズムや細胞融合メカニズムについては殆ど解析されていないのが現状である。とりわけ細胞膜上の糖鎖の機能解析は、今後筋疾患や発生を理解する上で、重要な課題であると考えている。本研究では現在までに筋分化に伴いガングリオシドの一種、GM3のシアル酸分子種がN-acetylneuraminic acid (Neu5Ac)からN-glycolylneuraminic acid (Neu5Gc)へと変化すること、及びセラミド分子種がd18:1-C24:0からd18:0-C16:0へと変化することの二つの現象を見いだした。また、この両者の制御は遺伝子転写レベルで行われ、シアル酸分子種はCMP-Neu5Ac水酸化酵素(CMAH)の発現上昇によってセラミド分子種はセラミド合成酵素(CerS2)の急激な発現減少によって制御されている事を報告してきた。
昨年度までに、筋芽細胞に発現しているCerS6に注目し更なる解析を行った結果、マウス筋芽細胞c2c12において現在まで知られていなかった新規の酵素、CerS6-var1の発見に至ったが、今年度はCerS6-var1が脳・骨格筋・心筋のみで発現していることを明らかにし、更に脳・筋ともに発生初期の段階で通常知られるCerS6-wtからCerS6-var1へと変化することを明らかにした。またCerS6-var1はCerS6-wtと比較し、酵素分解速度が遅く寿命が長いことを、シクロヘキシミドの添加実験より明らかにした。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
1: 当初の計画以上に進展している
理由
本研究は筋分化に伴う糖脂質のシアル酸分子種変化とセラミド分子種変化の二つについて解析を行っており、本年度は特にセラミド分子種変化について大きな進展が見られた。
第一に昨年度新たに発見したCerS6-var1の発現部位特異性について、マウスの組織より得られた各臓器のcDNAを用いてCerS6-var1の発現を調べたところ、脳・骨格筋・心筋のみで発現が確認された。更に脳の発達段階でCerS6の発現変化を調べるため、胎齢14日から20日までのマウス胎児脳のcDNAを用いて解析した結果、胎齢14日まではCerS6-wt、-var1共に発現するのに対し、それ以降はCerS6-var1のみの発現になる事が示された。
第二にCerS6-wtまたはCerS6-var1をそれぞれ強制発現させたc2c12細胞を作製し、酵素の発現量についてWestern Blotting法(WB)とReal-time-PCR法で解析を行った結果、c2c12細胞CerS6-var1はそのCerS6-wtと比較し、遺伝子発現量に対して酵素発現量が非常に高いことが明らかになった。更にシクロヘキシミドを用いて、それぞれの細胞における酵素分解速度について解析を行った結果、CerS6-var1は-wtと比較して分解されにくいことが示された。またMockを導入したc2c12細胞とCerS6-wt、あるいはCerS6-var1を導入した細胞において、細胞の遊走性に関与するリン酸化パキシリン量の変化をWBにて解析した。その結果、CerS6-wt、-var1を発現させた細胞ではmockと比較しリン酸化パキシリン量が顕著に増加している事が示された。
以上の結果から、CerS6-var1は酵素代謝速度が-wtと比較し遅いことから、同量の遺伝子発現量であった時、CerS6-var1は-wtよりも多くのセラミドを生合成出来ることが予測される。
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| 今後の研究の推進方策 |
本研究は筋細胞膜上に発現している糖鎖構造に注目し、筋分化によって変化するガングリオシド分子種の機能的役割を明らかにするため研究を行っている。
今後は(1)本年度新規に発見したCerS6-var1の更なる機能解析に加えて、シアル酸分子種変化に着目して、(2)CMAHを発現させた筋芽細胞での機能的変化についての解析、(3)CMAHのNeu5Gc生合成能以外の酵素機能解析の三つを主軸に行う予定である。(1)に対する方策として、CerS6-wt、-var1強制発現c2c12細胞株を用い、合成されたセラミドの組成解析を行う。（2)に対して、既に私は、Neu5Gcの発現は形成された筋管繊維上ではなく、その周囲に存在する未分化の細胞であることを見いだしており、この単核の細胞が筋繊維にどのように影響を及ぼしているのかを検証する。そのために、樹立したCMAH高発現c2c12細胞株を用いて、細胞間相互作用解析を行う。また私はc2c12細胞の分化過程のおいて、細胞からRaft画分を調製して解析した結果、Neu5Gcを含む分子は糖脂質のみであることを見出している。この意義の解明のために、CMAH高発現株とControl細胞株のRaft画分に発現しているタンパク質の種類と量の変化を免疫学的手法・銀染色法などを用いて解析する。(3)に対しては、現在ヒトCMAH偽遺伝子のクローニング、発現ベクターの構築を行っている。ヒトCMAH偽遺伝子は他動物種のCMAHと比較しよく保存された配列を持っているが、活性部位であるexon6が欠損しているため、活性を持たないことが知られている。これまでに私は、ヒト筋芽細胞においてCMAH偽遺伝子の発現を確認している。一方、現在までにCMAHのexon6以外の部分の役割について報告が無い事から、本研究ではCMAH偽遺伝子発現株を作成し、発現意義について解析を行う。
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