| 研究課題/領域番号 |
17J06627
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
小田 春佳 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| キーワード | 核アクチン / ZGA |
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| 研究実績の概要 |
動物の受精直後の胚は多くの場合、転写が抑制され未分化な状態を維持したまま、短い細胞周期を同調的に繰り返すという特徴を有する。アフリカツメガエルやゼブラフィッシュでは、この特徴が受精からしばらくの間維持されており、アフリカツメガエルは12回の、ゼブラフィッシュは10回の同調した細胞分裂を繰り返したのち、胚の遺伝子の転写が活性化され（ZGA: zygotic genome activation）細胞分化が開始するとともに、細胞周期の延長や同調性の喪失が起こる。私はこれまでアフリカツメガエルを用いて、重合したアクチン（F-アクチン）がZGA以前の胚の核に蓄積することを見出した。さらに、アクチン結合タンパク質をマーカーとして用いた胚のライブイメージングにより、ゼブラフィッシュにおいてもZGA以前の胚の核にアクチンが高密度に蓄積することを明らかにした。アフリカツメガエルでもゼブラフィッシュにおいても、ZGA以降の胚では核アクチンが急激に減少することから、アクチンの蓄積は、ZGA以前の未分化な細胞の核の機能に関与する可能性が高いと考えられた。そのため、当該年度は核アクチンとZGAの関係について検証した。その結果、核アクチンの重合を阻害したり、ZGA以降の核アクチンの減少を抑制したりしても、ZGAのタイミングや転写活性化の度合いには影響が見られなかった。また、初期胚細胞が短い細胞周期を繰り返す時期にアクチンが核に蓄積することから、短時間での染色体高次構造の構築にアクチンが関与しうると予測し、分裂期特異的なヒストン修飾状態についても検証したが、核アクチンの重合阻害による影響は確認されなかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
当該年度は、ゼブラフィッシュ初期胚を用い核アクチンの役割を明らかにすることを目指した。初期胚の核へのアクチンの蓄積を阻害するため、アクチンの核外輸送因子であるExportin6をゼブラフィッシュ初期胚に発現させた。しかしながら、Exportin6は核への移行量が少なく、核アクチンを減少させるに至らなかった。次に、アクチンの62番目のアルギニンをアスパラギン酸に置換し、重合を阻害する変異体（ActinR62D）を用い、核内のアクチンの重合のみを阻害したいと考えた。Actin R62Dを核に蓄積させるため、SV40の核移行シグナル（NLS）付加し、ActinR62D - SV40 NLSをゼブラフィッシュ胚に発現させたが、初期胚の核には蓄積しなかった。そこで、初期胚で高効率にNLSとして機能するアミノ酸配列を探索し、ヌクレオプラスミンのC末端側領域を同定した。このNLSをActinR62Dに付加し、核アクチンの重合を阻害した。アフリカツメガエルを用いた研究により、核アクチンの重合阻害は、分裂期の染色体高次構造の構築や転写の抑制に関与する可能性がある予想された。そこで、核内のアクチン重合を阻害したゼブラフィッシュ初期胚における、分裂期特異的なヒストン修飾状態や、転写状態を反映するRNA polymerase II のリン酸化状態をライブイメージングにより解析した。予想に反して核内のアクチン重合を阻害しても、ヒストン修飾状態や転写状態は、コントロールと差がなく、核アクチンの役割を明らかにすることができなかった。また、ZGA以降は核アクチン量が減少するため、ZGAの開始やその後の細胞分化に核アクチンが関与する可能性も考えられた。そこでZGA以降の核アクチンの減少を抑制する実験を行ったが、核アクチンの減少抑制はヒストン修飾状態や転写状態に変化を及ぼさなかった。
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| 今後の研究の推進方策 |
ZGA以前の胚では核内のアクチン密度は高く、ZGA以降は減少することから、核アクチンが転写の活性化に関与すると予測していたが、これまでにそのような結果は得られなかった。アクチンは重合と脱重合を活発に繰り返すことから、核へのアクチンの蓄積は核質の物質の流動性を変化させる可能性があると考えた。これを検証するため、今後はZGA前後の胚の核内における分子の拡散の速さを計測する。具体的には、光刺激によって蛍光を発するタンパク質PAGFP（photoactivatable GFP）を用い、これにNLSを付加してゼブラフィッシュ初期胚の核に蓄積させる。核内のごく小さい領域に光刺激を加え、光刺激後の蛍光の拡散を計測することで、核質の物質流動性を解析し核アクチンとの関わりを明らかにする。また、間期から分裂期に移行する際の核内アクチンの挙動について、より時間分解能の高いライブイメージングを行って解析する。
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