| 研究課題/領域番号 |
17J07322
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| 研究機関 | 山形大学 |
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研究代表者 |
田代 晋也 山形大学, 理学部, 特別研究員(PD)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| キーワード | オルガネラ間コンタクト / ミトコンドリア / ER / GFP |
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| 研究実績の概要 |
本研究の目的は、哺乳類細胞においてミトコンドリア-ER間コンタクトを制御する因子を、遺伝学的スクリーニングにより同定することである。初年度の目標はミトコンドリア-ER間コンタクトを定量的に検出可能な実験系を確立することだった。
本年度では、split GFPを用いてミトコンドリア-ER間コンタクトを検出する系を樹立した。Split GFPは緑色蛍光蛋白質GFPをN末端断片とC末端断片に分割した蛋白質である。二つのオルガネラ(ミトコンドリア、ER)の膜上に各種局在配列を用いてsplit GFPの断片をそれぞれ発現させると、膜間が十分に近接(~数nm)したとき、GFPが再構成され、蛍光を発する。このようにしてGFP蛍光の強度により膜間の近接度を評価する系の樹立を目標に本年度の研究を進めた。
まずpIRESベクターによってHeLa細胞内でミトコンドリア膜上(Tom70 -GFP11)とER膜上(ERj1-GFP1-10)にsplit GFPを発現させ、抗生物質による選択とクローン化ののち、蛍光顕微鏡で観察した。結果、ミトコンドリア上にドット状のsplit GFP由来のGFP蛍光シグナルが検出された。
次にsplit GFP発現がスクリーニングに与える影響を抑えるため、テトラサイクリンの添加によってsplit GFPの発現を制御することが可能な系の構築を目指した。split GFPのC末端側断片融合タンパク質をテトラサイクリン発現誘導ベクターであるpTETOneベクターで、N末端側断片融合タンパク質はpIRESベクターでHeLa細胞内で発現させた。抗生物質による選択後、Flow Cytometry、蛍光顕微鏡で検証したところ、Doxycyclineの添加に応じてミトコンドリア上でのGFP蛍光が観察された。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
本研究の目的はミトコンドリア-ER間コンタクト制御因子のスクリーニングによる同定であり、それを踏まえたうえで本年度の目標はスクリーニングに向けて系を樹立することであった。
本年度の研究によりHeLa細胞内でsplit GFPによってミトコンドリア-ER間コンタクトの検出が可能であることが示唆され、pIRESベクターによってsplit GFPを安定的に発現するHeLa細胞株がクローンを樹立した。これは次年度のミトコンドリア-ER間コンタクト制御因子をスクリーニングするための検出系の候補となる細胞系が得られたことを意味し、重要な研究成果である。一方で新たな問題点として、過剰なsplit GFP発現とそれに伴うミトコンドリアの変形が観察された。これはsplit GFPの不可逆な再構成によってミトコンドリア-ER膜間の近接が誘導されているためと考えられ、スクリーニングを実施するうえで障害になる可能性がある。そこで本年度では既に樹立されたsplit GFP安定発現細胞株に加え、テトラサイクリン誘導発現ベクターを用いたsplit GFP安定発現細胞株の樹立を試みている。本年度の研究により、ドキシサイクリンによってsplit GFPの発現制御が可能なHeLa細胞が得られた。この成果は上述のsplit GFPの不可逆的な再構成のタイミングの制御を可能とするものである。適切な誘導タイミングの検討が今後必要であるものの、split GFPの不可逆な再構成によるスクリーニングへの影響を回避するために重要な成果といえる。
以上から、本年度の目標であったスクリーニングのための検出系の樹立はおおむね順調に進展しているといえる。
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| 今後の研究の推進方策 |
これまでの研究からsplit GFPの発現タイミング、発現量をテトラサイクリン及びその類縁体の添加によって制御可能な系が樹立された。今後はこれを活用してミトコンドリア-ER間コンタクトの制御因子のスクリーニングを目標として研究を進めていく。
具体的には、まずスクリーニングの予備検討を行う。今回得られたテトラサイクリン発現誘導系について、ドキシサイクリンに対する応答性の詳細な解析(薬剤添加とsplit GFP発現のタイミングのずれや、薬剤添加量とsplit GFP発現量、蛍光強度の相関)を行う。並行して既知のミトコンドリア-ER間相互作用制御因子を本細胞系内でノックダウンしたとき、split GFPの蛍光がどのように変化するかを検証する。特に後者についてはsplit GFPによるミトコンドリア-ER間コンタクトの誘導を回避してスクリーニングを実施するうえで重要である。これらの解析によって今後のスクリーニングの際のドキシサイクリンの添加タイミング、添加量を決定する。
以上で決定された条件に基づいてスクリーニングを実施する。スクリーニングの内容としては、画像解析を用いたスクリーニングとFlow Cytometryを用いたスクリーニングの二種類を予定している。前者はsiRNAライブラリを用い、siRNAによる阻害後のGFP蛍光の様子の変化に基づいてスクリーニングを行う。後者はCRISPR-CAS9ライブラリを用いるもので、遺伝子をノックアウトしたのちに蛍光強度が変化した細胞をFlow Cytometryによって濃縮を繰り返すことによりミトコンドリア-ER間相互作用に変化が生じた細胞を選択する。
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