| 研究課題/領域番号 |
17J09227
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| 研究機関 | 愛媛大学 |
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研究代表者 |
秋月 一駿 愛媛大学, 連合農学研究科, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| キーワード | CaMKI / プロテインキナーゼ / ゼブラフィッシュ / 活性調節機構 / 自己リン酸化 |
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| 研究実績の概要 |
当研究室では、ゼブラフィッシュ胚発生過程の鍵酵素としてカルモジュリン依存性プロテインキナーゼ Iδ (CaMKIδ)を同定した．CaMKIはCa2+シグナルの下流で働き、上流のCaMKKによるリン酸化により強く活性化する．本研究では、CaMKIδの詳細な活性調節機構や器官形成における生理機能の解明を目的とした．
1. 新規活性化メカニズムの解析
我々は、大腸菌で発現させたCaMKIδ(1-299)がCaMKKのリン酸化を受けなくても活性化していること、そして高度に自己リン酸化していることを見出した．自己リン酸化と酵素活性の因果関係を調べるために、λホスファターゼを発現する大腸菌株を開発し、これを用いて取得したCaMKIδ(1-299)の自己リン酸化状態及びキナーゼ活性を調べたところ、λホスファターゼによりCaMKIδ(1-299)の自己リン酸化は無効化され、さらにキナーゼ活性も消失することが明らかになった．このことから、CaMKIδ(1-299)は自己リン酸化により高活性化することが判明した．さらに興味部深いことに、CaMKIδ(1-299)の自己リン酸化部位は、CaMKKによるリン酸化部位と同一でないことが判り、CaMKIδ(1-299)はこれまでに報告のない部位のリン酸化を介した新しいメカニズムで活性化することが示唆された．
2. 軟骨形成における生理機能の解明
ゼブラフィッシュ胚においてCaMKIδの遺伝子ノックダウンを行うと軟骨に異常が観察される．この分子メカニズムを明らかにするためにCaMKIδの結合タンパク質を解析したところ、転写因子 (Dlx1とDlx5) が同定された．そこで大腸菌でDlx1, 5を発現させたところ封入体を形成したため、可溶化精製後に再生化し、キナーゼアッセイの基質に用いた．その結果、CaMKIδはDlx1,5をリン酸化することが明らかになった．
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
CaMKIδ(1-299)の活性化メカニズムについては、MSによるリン酸化部位の同定を試み、活性に重要なリン酸化部位がかなり絞られてきている．また、脱リン酸化型CaMKIδ(1-299)の取得に際して、大腸菌内でプロテインホスファターゼと共発現させるという新たな手法を開発し、CaMKIδ(1-299)が大腸菌内で高度に自己リン酸化することで高活性化することを直接的に証明した．さらに、この実験のために開発した大腸菌株 BL21(DE3)pλPPは、自己リン酸化により不活性化してしまうカゼインキナーゼを始めとした他のプロテインキナーゼの調製にも非常に有用であり、この手法に関する論文をAnalytical Biochemistry誌に発表した．また、CaMKIδの新規基質候補であるDlx1,5についてもさらなる発現条件検討を経て、可溶性画分での発現精製に成功したため、より生理的な条件での解析が可能になった．
以上より、順調にかつ着実に研究が進展していると評価した．
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| 今後の研究の推進方策 |
新規活性化メカニズムについては、絞られたリン酸化候補サイトのAla置換した変異体を作製し、生化学的に活性化に重要なリン酸化サイトを同定する．また、基質候補であるDlx1, Dlx5に関しては、可溶性画分から取得したDlx1, 5がCaMKIδによってリン酸化されるか、リン酸化部位やその生理的意義について調べる予定である．
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