| 研究課題/領域番号 |
17J09664
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| 研究機関 | 東京工業大学 |
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研究代表者 |
鈴木 星冴 東京工業大学, 物質理工学院, 特別研究員(DC1)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| キーワード | 温度応答性 / 生体高分子 / 分子認識 / 水性二相系 / 分離 / ファージディスプレイ |
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| 研究実績の概要 |
昨年度までに、代表的な温度応答性高分子であるポリ(N-イソプロピルアクリルアミド) (PNIPAM) に特異的に結合するペプチドをタンパク質に修飾することで、タンパク質をPNIPAMと相転移温度以上で共沈殿させて分離できることを明らかにしている。しかしながら、PNIPAMとの共沈殿によって、タンパク質が凝集し、変性することによる機能の損失が懸念されていた。そこで本年度は、二種類の水溶性高分子の水溶液が相分離した状態である水性二相系に着目し、タンパク質の二相間の分配をペプチドの結合を利用して制御することで、PNIPAMを沈殿することなく、より温和な条件下でタンパク質を分離することを目指した。
ポリエチレングリコール（PEG）とデキストラン（Dex）の水溶液からなる水性二相系では、PNIPAMはPEG相へと分配されることがわかった。モデルタンパク質として緑色蛍光タンパク質（GFP）を用い、GFPのN末端側にPNIPAM結合性ペプチドを遺伝子工学的に融合した。PNIPAMを含んだ水性二相系におけるペプチド融合GFPの分配を評価した結果、PNIPAM非存在下では20%程度しかGFPはPEG相へと分配されなかったのに対し、PNIPAM存在下では70%程度のGFPがPEG相へと分配されることがわかった。一方で、ペプチド未融合の野生型のGFPの場合にはPNIPAMの有無によらず、ほとんどがDex相へと分配された。これはタンパク質に融合されたペプチドとPNIPAM間の特異的な結合が水性二相系においても機能しており、GFPがPNIPAMとともにPEG相へと分配されたことを示している。また円二色性スペクトル測定の結果、水性二相系におけるGFPは常にオリジナルの二次構造を維持しており、本手法がタンパク質の構造や機能を損なうことなく温和な条件下でタンパク質の分離に利用できる可能性が明らかとなった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ペプチドの結合を利用したタンパク質の分離をこれまでのPNIPAMとの共沈殿による手法から水性二相系を利用し手法へと拡張し、より温和な条件下でのタンパク質の分離を達成した。さらに相転移温度以上での遠心により沈殿できるPNIPAMはアニオン重合法により合成したPNIPAMに限られていた。一方で水性二相系を用いた分離法では、PNIPAMを沈殿させる必要がないため、相転移温度以上での遠心によっても沈殿しないラジカル重合により合成した一般的なPNIPAMを用いることができ、より汎用的なタンパク質の分離を実現できることを見出した。
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| 今後の研究の推進方策 |
水に溶解したPNIPAMとペプチドの結合をさらに明らかにすることを目指す。これまでに、PNIPAM結合性ペプチドの末端に環境応答性の蛍光プローブを導入することで、蛍光ブローブの蛍光強度がPNIPAM存在下で増大することを明らかにしている。そこで、ペプチドに導入した蛍光プローブの蛍光強度を指標にして、ペプチドの結合様式を明らかにする。さらに用いた蛍光ブローブはPNIPAMとの結合に伴い蛍光強度が増大するのみならず、ペプチド周囲の新疎水性環境の違いにより、蛍光波長がシフトすることが知られている。そこで、蛍光の強度と色調の変化を統計学的に解析することで、最終的に水中に存在しているPNIPAMの検出を目指す。
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