2017 年度実績報告書

DUX4融合遺伝子陽性B細胞性急性リンパ性白血病の病態解明

研究課題

研究課題/領域番号	17J10130
研究機関	東京大学
研究代表者	田中庸介東京大学, 大学院医学系研究科, 特別研究員(DC1)
研究期間 (年度)	2017-04-26 – 2020-03-31
キーワード	転写活性
研究実績の概要	本研究はDUX4融合遺伝子を有する白血病におけるDUX4融合遺伝子の機能の解明を目標としている。まず、DUX4融合遺伝子を有するB細胞性白血病細胞株であるNALM6及びDUX4融合遺伝子を有さないB細胞性白血病細胞株であるRehを用い、DUX4抗体を用いたクロマチン免疫沈降シーケンス(ChIP-seq)を施行し、DUX4融合タンパクが野生型DUX4タンパクと同様のDNA結合能を有することを確認した。 DNA結合能は類似していても野生型DUX4とDUX4-IGHでは機能が異なっているため、NALM6においてDUX4-IGH(NALM6型)を異所性に発現させて、RNA-seqにより発現の比較を行った。野生型DUX4によって誘導される遺伝子のうちDUX4-IGH(NALM6型)との間でオーバーラップするものは3.8%のみであった。DUX4-IGHのNALM6におけるChIP-seqでは野生型DUX4のターゲット遺伝子への結合は認めたが、発現解析においては野生型DUX4の異所性発現では十分な転写活性を認める一方で、DUX4-IGHでは発現誘導を認めず、DUX4-IGHの転写活性は野生型に比して減弱しており、その活性は野生型DUX4とは異なることが示唆された。また、DUX4-IGHをノックダウンすることによる発現への影響をNALM6でのRNA-seqで確認し、DUX4-IGHによって正に制御されている遺伝子を同定した。そのうちChIP-seqにおいてDUX4-IGHの結合が確認されたものは14%であり、ほとんどが間接的に制御されていると考えられた。これらの上昇、減少パターンはRehに異所性にDUX4-IGHを発現させた場合及び臨床サンプルの発現データでも同様のパターンを認めており、DUX4融合遺伝子陽性白血病におけるDUX4-IGHによる特有の遺伝子制御が示唆された。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由まず、DUX4融合タンパクが野生型DUX4タンパクと同様のDNA結合パターンを示す一方で転写活性が減弱していることを示した。また、NALM6においてDUX4-IGHをノックダウンすることで発現が減少した遺伝子はDUX4-IGHによって正に制御されていると考えられるが、中でもChIP-seqにおいてDUX4-IGHの結合が確認されたものは14%であり、ほとんどが間接的に制御されていると考えられた。これらの上昇、減少パターンはRehに異所性にDUX4-IGHを発現させた場合及び臨床サンプルの発現データでも同様のパターンを認めており、DUX4-IGHによる特有の遺伝子制御が示唆された。しかしながら、これらのターゲット遺伝子のうち、細胞伝達に関わっている既報のある遺伝子のノックダウンをNALM6において試行したが、単一のノックダウンでは細胞増殖が減弱することはなかった。また、DUX4融合遺伝子がIgHエンハンサー(Eμ)により発現誘導されるベクターを作成し、トランスジェニックマウスの作成を試みた。得られた第一世代の個体の骨髄中のDUX4 mRNA発現量についてスクリーニングを行ったところ、ほとんどのgenotype陽性個体においてDUX4 mRNAが認められず、転写抑制が働いていることが示唆された。その中でもDUX4-IGH低コピー導入個体においてDUX4の発現が認められる個体を見出し、それらの精子を用いて個体化作業を進めている。また、DUX4-IGH融合遺伝子陽性の患者検体を入手し、NSGマウスに移植を行ったところ、生着を認め、PDXマウスの樹立に成功した。また、現在さらに1例のDUX4-IGH融合遺伝子陽性検体を入手し、移植中である。
今後の研究の推進方策	DUX4-IGHの転写活性について検討を進めて行く過程で、野生型のDUX4とDUX4-IGHの転写活性とが異なることが示された。しかしながら、現状の転写因子としてのDUX4-IGHに着目したターゲット遺伝子スクリーニングにおいては白血化を説明できる下流遺伝子は同定できておらず、80%程度の遺伝子が間接的に制御されている事実や、DUX4-IGHの転写活性の低さからも、別の未分化性の獲得メカニズムを検討すべきと考えている。その一環として、DUX4-IGHに結合するタンパクを免役沈降法及び質量分析法を用いた網羅的解析を行っており、実際にDUX4-IGHと結合するタンパクを数個同定している。それらの白血化への関与の解析を進めている。また、トランスジェニックマウスに関しては、骨髄中にDUX4の発現が認められる個体を確認しており、そららの表現系の観察を続け、解析する予定である。 PDXマウスに関しては、現在樹立したマウスの解析を進めるとともに、さらに患者検体収集を続けて、複数のマウスの樹立を目指す。