植物有用メロテルペノイドの生合成メカニズム解明から物質生産へ

2018 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17J10178
• 研究機関: 富山大学
• 研究代表者: 飯島 未宇 富山大学, 大学院医学薬学教育部, 特別研究員(DC2)
• 研究期間 (年度): 2017-04-26 – 2019-03-31
• キーワード: 植物 / メロテルペノイド / 抗HIV

研究実績の概要

エゾムラサキツツジが生産するメロテルペノイドの一種ダウリクロメン酸（daurichromenic acid、DCA）は極めて強力な抗HIV活性を示す。
本研究では、植物メロテルペノイド酸化閉環酵素であるDCA synthase及びカンナビノイド合成酵素（THCA synthase）の結晶構造解析による構造機能の解明を目的として、その基盤となる組換え酵素の発現システムについて各種宿主を用いて検討を行った。本年度はBY-2に比べ遺伝子組換えが容易で、また組換え酵素の酵素的な糖鎖除去が可能である酵母Pichia pastorisを宿主とし、DCA synthase及びTHCA synthaseの高発現株の作製を試みた。
まずTHCA synthase及びDCA synthaseのcDNAをpPICZAベクターに挿入し、発現カセットを作製した。次いで各発現カセットを切り出し、複数遺伝子の挿入が可能なpAO815及びpPIC3.5Kに順次組み込むことで、各遺伝子の発現カセットを3コピー含むベクターを構築した。次いでエレクトロポレーション法を用いた相同組換えにより P. pastoris に形質転換し、DCA synthaseあるいはTHCA synthaseの発現カセットを1, 4及び7コピー導入した組換え体をそれぞれ調製した。メタノールで発現誘導し、細胞外に分泌した各酵素の活性を測定した結果、THCA synthase及びDCA synthase発現株いずれも、単一コピー組換え体に比べ、4コピー及び7コピー組み換え体ではコピー数の増加に依存して比活性の上昇が確認された。組換え酵素を精製した結果、THCA synthase及びDCA synthaseはいずれも糖鎖付加を受けていることが示唆されたため、7コピー発現株にendoglycosidase Hを導入して共発現株を作製した。

現在までの達成度 (段落)

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

今後の研究の推進方策

平成30年度が最終年度であるため、記入しない。

研究成果

• [国際共同研究] John Innes Centre(英国)
  • 国名: 英国
  • 外国機関名: John Innes Centre
• [雑誌論文] An aromatic farnesyltransferase functions in biosynthesis of the anti-HIV meroterpenoid daurichrmenic acid (2018)
  • 著者名/発表者名: Haruna Saeki, Ryota Hara, Hironobu Takahashi, Miu Iijima, Ryosuke Munakata, Hiromichi Kenmoku, Kazuma Fuku, Ai Sekihara, Yoko Yasuno, Tetsuro Shinada, Daijiro Ueda, Tomoyuki Nishi, Tsutomu Sato, Yoshinori Asakawa, Fumiya Kurosaki, Kazufumi Yazaki, Futoshi Taura
  • 雑誌名: Plant Physiology 巻: 178 (2) ページ: 535-551
  • DOI: https://doi.org/10.1104/pp.18.00655
  • 査読あり / オープンアクセス
• [学会発表] 抗HIV天然物ダウリクロメン酸生産系の開発に向けた基礎研究 (2019)
  • 著者名/発表者名: 飯島未宇、黒崎文也、田浦太志
  • 学会等名: 日本農芸化学会2019年度大会（東京）
• [学会発表] エゾムラサキツツジが生産する抗HIV天然物ダウリクロメン酸の生合成経路 (2018)
  • 著者名/発表者名: 田浦太志、飯島未宇、矢崎一史、黒崎文也
  • 学会等名: 第36回日本植物細胞分子生物学会（金沢）
• [学会発表] ダウリクロメン酸生合成経路で機能する芳香族ファルネシル転移酵素 (2018)
  • 著者名/発表者名: 田浦太志、佐伯春奈、原良太、飯島未宇、黒崎文也
  • 学会等名: 第22回天然薬物の開発と応用シンポジウム（熊本）
• [学会発表] 植物二次代謝経路のファルネシル転移酵素 (2018)
  • 著者名/発表者名: 田浦太志、棚谷綾介、佐伯春奈、飯島未宇、黒崎文也、高橋宏暢
  • 学会等名: 日本薬学会第139年会（千葉）