| 研究課題/領域番号 |
17J40083
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| 研究機関 | 東京大学 |
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研究代表者 |
吉田 彩子 東京大学, 生物生産工学研究センター, 特別研究員(RPD)
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| 研究期間 (年度) |
2017-04-26 – 2020-03-31
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| キーワード | タンパク質アシル化修飾 / Thermus thermophilus / ロイシン生合成 / CoA体代謝 / 短鎖脂肪酸 |
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| 研究実績の概要 |
①Thermus thermophilusのロイシン生合成酵素のアシル化修飾による活性制御機構の解析
・アセチル化を受けるロイシン生合成の初発酵素である2-isopropylmalate synthase (IPMS)について、そのアセチル化および脱アセチル化機構を解析した。アセチル化はacetyl-CoAを基質として少なくとも非酵素的に進行し、脱アセチル化はT. thermophilusの持つリジン脱アセチル化酵素（KDAC）ホモログのうち一つが担うことがわかった。非酵素的なアセチル化によりIPMS活性は低下し、アセチル化IPMSをKDACにより脱アセチル化すると、活性が回復することが示された。変異体解析により、この可逆的なアセチル化による活性調節には、IPMSの触媒やロイシンによるフィードバック阻害に重要であるリンカードメイン中のリジン残基が重要であることが示唆された。
・スクシニル化を受けるロイシン生合成酵素の3-isopropylmalate dehydrogenase（IPMDH）についてもスクシニル化修飾を受けるリジン残基について修飾模倣変異を用いた活性測定を行い、IPMDH活性のスクシニル化による調節に重要であると考えられるリジン残基を特定した。
②T. thermophilusのCoA体代謝酵素のアセチル化修飾による調節機構の解析
CoA transferase (CoAT)はアセチル化を受けるとともに、alanine dehydrogenaseホモログ（ADLP)と相互作用し、ADLPとNAD+共存下で活性阻害を受ける。CoATのADLP・NAD+による阻害へのアセチル化の影響を調べたところ、CoATのアセチル化は、ADLP・NAD+による阻害効果を緩和することがわかった。CoAT活性がアセチル化とタンパク質間相互作用によって調節されていることがわかった。
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| 現在までの達成度 (区分) |
現在までの達成度 (区分)
2: おおむね順調に進展している
理由
ロイシン生合成酵素IPMSについては、アセチル化酵素の同定には至っていないものの、可逆的な（脱）アセチル化によりIPMS活性が調節されること、さらにその調節に重要なリジン残基を明らかにすることができた。IPMSはスクシニル化されるが、スクシニル化による活性への影響ははっきりとしなかったが、同じくロイシン生合成酵素であるIPMDHについて変異体解析により、スクシニル化が活性調節に寄与する可能性を見出すことができた。
CoATの活性調節機構について、CoAT単独ではアセチル化による影響は見られなかったが、ADLP・NAD+による阻害効果に対して、アセチル化は阻害を緩和する働きがあることを明らかにできた。しかし未だこの複雑な調節機構の生理的意義を明らかにできていない。現在までにそれぞれの遺伝子破壊株の作製は済んでいるので、今後それらを活用して生育などの解析を行っていく。
また、CoATと同じくCoA体代謝関連酵素であるアセチルCoA合成酵素(ACS)についても解析を進め、4つのACSのうち少なくとも一つが細胞内で酵素的にアセチル化修飾を受けていることを明らかにできた。
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| 今後の研究の推進方策 |
①ロイシン生合成酵素のアシル化修飾による活性制御機構の解析
アセチル化による調節機構を解析しているIPMSについては、KATの同定について遺伝子破壊株を用いたin vivoでの解析を行う。その結果が得られ次第、論文投稿準備を始める。
スクシニル化により活性調節を受けることが示唆されているIPMDHについては、IPMSと同様にスクシニル化及び脱スクシニル化酵素の同定やその活性への影響を調べていく。また、それぞれの酵素に関して、細胞内のロイシン濃度とアシル化修飾の状態を調べることで、細胞内でのロイシン生合成の調節におけるアシル化修飾の意義を明らかにしたい。
②CoA体代謝酵素のアセチル化修飾による調節機構の解析
CoAT・ADLP複合体の結晶構造解析を進めているが、構造決定には至っていないため、精製条件や結晶化条件の探索を進める。CoATのアセチル化やADLPとの相互作用による活性調節の生理的意義について明らかにしたい。具体的には、それぞれの遺伝子破壊株を用いて細胞内のacetyl-CoAや短鎖脂肪酸濃度、NAD+/NADH比などを測定することで、acetyl-CoAをはじめとするCoA体の恒常性維持との関連を調べていく。
さらに、Salmonella enterica由来のacetyl-CoA合成酵素ACSはアセチル化により活性調節されることが知られている。T. thermophilusにもACSが4つ存在することから、これらもS. enterica同様にアセチル化により制御されるか、またその制御と上記のCoATの制御との関連に興味が持たれる。アセチル化酵素破壊株の解析から、少なくとも1つのACSがアセチル化されることが示唆されており、in vitroでのアセチル化反応やアセチル化によるACS活性への影響などを調べていく予定である。
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