2017 年度実績報告書

細胞外マトリックス蛋白質polydom/SVEP1の脈管発生寄与機構の解明

研究課題

研究課題/領域番号	17J40191
研究機関	大阪大学
研究代表者	佐藤(西内) 涼子大阪大学, たんぱく質研究所, 特別研究員(RPD)
研究期間 (年度)	2017-04-26 – 2020-03-31
キーワード	細胞外マトリックス / polydom / アンジオポエチン / リンパ管発生
研究実績の概要	Polydomはリンパ管発生に重要な細胞外マトリックス蛋白質であり、ノックアウト(KO)マウスは、胎児期に重篤なリンパ浮腫を起こし、出生直後に呼吸不全で死亡する。我々はKOマウスの解析中にpolydomがリンパ管内皮細胞成長因子のアンジオポエチン-2 (Ang2)と結合することを見出した。Ang2のKOマウスもリンパ管の発生異常が報告されていることから、polydomとAng2との相互作用がリンパ管発生に寄与しているのではないかと我々は考えた。そこで本研究では、polydomとAng2との相互作用機構を解明することを試みた。最初に、polydomをN末端から順次削った欠損変異体を哺乳動物細胞の293F細胞で発現させ、組換え蛋白質として精製してAng2との結合を解析した。その結果、polydomのN末端側から数えて21番目のCCP (CCP21)ドメインを欠損させると、Ang2が結合できなくなったことから、CCP21がAng2との結合に重要なドメインであることが明らかとなった。次にCCP21上でAng2との結合に関与する領域を特定するため、CCP21ドメイン単独、あるいはネガティブコントロールとして22番目のCCP (CCP22)ドメイン単独を、Fc融合組換え蛋白質として、293F細胞を用いて発現、精製した。作製した組換え蛋白質とAng2との結合を解析したところ、Ang2はFcならびにCCP22-Fcには結合しないが、CCP21-Fcへ特異的に結合することが明らかとなった。続いてCCP21とCCP22の配列の一部を交換したキメラ変異体をいくつか作製してAng2との結合を解析したところ、CCP21のN末端側に存在する11アミノ酸残基をCCP22の配列に置換するとAng2との結合が失われることが分かった。これから、CCP21のN末端領域にAng2との結合に重要な配列が含まれていることが明らかとなった。
現在までの達成度 (区分)	現在までの達成度 (区分) 2: おおむね順調に進展している理由平成29年度はリンパ管内皮細胞成長因子のアンジオポエチン-2 (Ang2)とpolydomとの相互作用機構の解明に取り組み、polydomのN末端側から数えて21番目のCCP (CCP21)ドメインにAng2が結合することを明らかにした。次にCCP21上でAng2が結合する領域を特定するため、CCP21ドメイン単独、あるいはネガティブコントロールとして22番目のCCP (CCP22)ドメイン単独を、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)融合組換え蛋白質として大腸菌で発現させて精製し、Ang2との結合を調べた。その結果当初の予想とは異なり、Ang2がGSTそのものにも非特異的に結合してしまい、CCP21による特異的な結合が検出できないことが判明した。そこで研究方式を見直し、動物細胞の293F細胞を用いてCCP21とCCP22ドメイン単独、あるいはそれらの一部の配列を交換したキメラ変異体をFc融合組換え蛋白質として作製した。その結果、CCP21のN末端側の11アミノ酸残基の中にAng2との結合に重要な配列が含まれていることを明らかにした。年度途中で当初の計画から研究方式を変更する必要が生じたものの、おおむね順調に研究が進展したと言える。
今後の研究の推進方策	今後はCCP21ドメインの変異体を組換え蛋白質として発現・精製して、Ang2との結合に関わるアミノ酸残基を特定する。得られた結果を元に、Ang2の結合部位に変異を入れたpolydom全長蛋白質を作製し、Ang2との結合が失われるかどうかを確認する。Ang2の組換え蛋白質およびそれらの変異体も作製して、Ang2上のpolydom結合部位の同定も試みる。また、polydomとAng2、Ang2受容体であるTieレセプターとの関係性についても解析する。具体的には、Tieレセプターがpolydomと直接相互作用するか、異なる蛋白質が同時にpolydomへ結合することができるかどうかを、固相結合アッセイやpull-downアッセイなどを行って判断する。それとは別に、野生型とAng2結合部位に変異を入れたpolydom蛋白質を利用して、培養リンパ管内皮細胞の移動能を評価する実験を行い、polydomとAng2の相互作用がリンパ管内皮細胞の挙動に与える影響を明らかにする。