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2017 年度 実施状況報告書

新規グアニン酸化損傷は突然変異源として、8オキソグアニンと同じ重要性を有するか?

研究課題

研究課題/領域番号 17K00558
研究機関徳島文理大学

研究代表者

喜納 克仁  徳島文理大学, 薬学部, 准教授 (70360534)

研究期間 (年度) 2017-04-01 – 2020-03-31
キーワードグアニン酸化損傷
研究実績の概要

酸化条件において、G→T点突然変異やG→C点突然変異が観測されているが、グアニン酸化損傷 である8オキソ グアニンでは G→C 点突然変異を説明できない。申請者はオキサゾロンが G→C 点 突然変異を説明できるグア ニン酸化損傷であると報告したが、オキサゾロンは徐々に分解することが最近明らかとなった。 そこで本研究では、申請者が発見した新規グアニン酸化損傷 X について、構造決定および突然変異能、修復 反応を調べる。本研究により、X が8オキソグアニンに匹敵する突然変異源になり得るかの可能性を探ることを目的とする。
平成29年度においては、Oz分解生成物Xを含む30merDNAの合成とDNAポリメラーゼによる解析を行った。まず、Oz分解生成物Xを含む30merDNAの合成:原料の5’-CTTGAA-3’から、5’-CTTXAA-3’を得た。この5’-CTTXAA-3’の分子量を解析し、Xがどのような構造を持つのか推測した。その上で、ポリヌクレ オチドキナーゼで5’をリン酸化した上で、ライゲーション法によりXを含む30merDNAを得、この30merDNAに対しても分子量測定を行い、問題なく30merDNAを得ることができた。蛍光色素ラベルした15merのDNAプライマーをアニーリングさせ、デオキシヌクレオシド3リン酸(dNTP) を1種類もしくは全種類加え、DNAポリメラーゼIexo-で塩基取り込み・伸長反応の解析を行った。その結果、Xを乗り越えて伸長する上、Gを優先的に取り込むことがわかった。

現在までの達成度 (区分)
現在までの達成度 (区分)

3: やや遅れている

理由

大学院生がいなくなったことにより、学部学生による遂行のため、計画より遅れている。

今後の研究の推進方策

引き続き、DNAポリメラーゼによる塩基取り込み・伸長反応の解析を行う。DNAポリメラーゼα、ζは購入し、DNAポリメラ ーゼδとεは過去の報告のようにプラスミドから調製する。挿入した塩基についての忠実度を調べるため、酵素濃度やdNTPの濃度を変化させ、 速度論的パラメータを求める。
さらに、Xの構造決定のため、分子量測定結果を基盤として、NMR解析を行う。そのために、大量のTXを必要とするため、まずは、手合成でTGを大量に合成した。これをもとに、TGからTXを生成する条件検討を検討し、大量のTXを精製した上で、構造解析を行いたい。

次年度使用額が生じた理由

研究の進展が計画より遅れていること、また、大学から支給される研究費でまかなったことが理由である。平成30年度は、非常勤職員を雇い、そのための人件費、かつ、TXの大量合成にかかる費用、DNAポリメラーゼの調製などで、それなりに支出する予定ではある。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2018 2017

すべて 雑誌論文 (1件) (うち査読あり 1件、 オープンアクセス 1件) 学会発表 (4件)

  • [雑誌論文] Generation, repair and replication of guanine oxidation products2017

    • 著者名/発表者名
      Katsuhito Kino*, Masayo Hirao-Suzuki, Masayuki Morikawa, Akane Sakaga and Hiroshi Miyazawa
    • 雑誌名

      Genes and Environment

      巻: 39 ページ: 21

    • DOI

      10.1186/s41021-017-0081-0

    • 査読あり / オープンアクセス
  • [学会発表] オキサゾロンの熱分解反応2018

    • 著者名/発表者名
      穴吹隆人, 喜納克仁, 所谷匡祐, 坂賀茜, 坪井里奈, 長船愛未, 大吉崇文, 小林隆信, 宮澤宏
    • 学会等名
      日本薬学会第138年会
  • [学会発表] 新規グアニン酸化損傷に関する解析2017

    • 著者名/発表者名
      坂賀茜, 喜納克仁, 穴吹隆人, 坪井里奈, 所谷匡祐, 小林隆信, 大吉崇文, 宮澤宏
    • 学会等名
      第56回日本薬学会・日本薬剤師会・日本病院薬剤師会中国四国支部学術大会
  • [学会発表] グアニン酸化損傷であるオキサゾロンの熱分解生成物に関する解析2017

    • 著者名/発表者名
      坂賀茜, 穴吹隆人, 坪井里奈, 所谷匡祐, 小林隆信, 大吉崇文, 宮澤宏, 喜納克仁
    • 学会等名
      第39回日本光医学・光生物学会
  • [学会発表] 新規グアニン酸化損傷の発見とDNAポリメラーゼによる塩基取り込み2017

    • 著者名/発表者名
      喜納克仁, 坂賀茜, 穴吹隆人, 坪井里奈, 所谷匡祐, 川上充希, 小林隆信, 大吉崇文, 宮澤宏
    • 学会等名
      第46回日本環境変異原学会

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公開日: 2018-12-17  

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