研究課題
酸化条件において、G→T点突然変異やG→C点突然変異が観測されているが、グアニン酸化損傷 である8オキソ グアニンでは G→C 点突然変異を説明できない。申請者はオキサゾロンが G→C 点 突然変異を説明できるグアニン酸化損傷であると報告したが、オキサゾロンは徐々に分解することが最近明らかとなった。 そこで本研究では、申請者が発見した新規グアニン酸化損傷Xについて、構造決定および突然変異能、修復反応を調べる。本研究により、X が8オキソグアニンに匹敵する突然変異源になり得るかの可能性を探ることを目的とする。平成２９年度の大腸菌由来のポリメラーゼに加えて、平成３０年度においては、Oz分解生成物Xを含む30merDNAの追合成とDNAポリメラーゼαやβによる解析を行った結果、どちらもDNAポリメラーゼIexo-と同様にXを乗り越えて伸長する上、Gを優先的に取り込むことがわかった。またそれに必要なXを含む30merDNAの追合成も平成２９年度と同様に行った。なお、DNAポリメラーゼδ、ε、ζ、ηについても実施した（学会未発表）。加えて、RIの法令改正により、主任者以外の方の業務や責任が増大することとなったため、当施設のRI施設を廃止することになった。以前はDNAオリゴマーにRIラベルをした基質を用いて修復酵素の活性を解析していたが、RI施設廃止に伴い、蛍光色素ラベルした基質でも修復酵素の活性を解析できるか否かについて再検討することとなった。そこで、Alexa680をラベルした8oxoG入りオリゴマーを受託合成依頼し、これを用いて大腸菌由来の塩基除去修復酵素について活性測定を解析しているところである。
4: 遅れている
分析機器の故障やマンパワーの不足、RI施設廃止に伴うRI代替の蛍光色素付加体の合成で手間取っているため。
DNAポリメラーゼδ、ε、ζ、ηを用いた結果について、どこかの学会で発表を行う。また、Alexa680を付加した損傷塩基入りDNAオリゴマーを受託合成および、研究室内にて合成し、Xの活性をポジティブコントロールと比較して、Xの修復されやすさについて考察する。加えて、ピペリジン処理や熱による不安定性についても解析する。さらに、Xの構造決定のため、分子量測定結果を基盤として、NMR解析を行う。そのために、大量のTXを必要とするため、まずは、手合成でTGを大量に合成し た。これをもとに、TGからTXを生成する条件検討を検討し、大量のTXを精製した上で、構造解析を行いたい。
研究の進展が計画より遅れていること、また、大学から支給される研究費でまかなったことが理由である。平成31年度は、非常勤職員を引き続き雇い、そのための人件費、かつ、TXの大量合成にかかる費用、修復酵素などの調製などで、それなりに支出する予定ではある。
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